Marqueur VASP : aspects méthodologiques, validation technique

Marqueur VASP :aspects méthodologiques, validation technique Pr L Camoin-Jau Pr J Sampol Laboratoire d’Hématologie INSERM EMI 0019 Hôpital de la Conception Marseille ******* GEHT Paris 9 et 10 Octobre

- + ADP PGE1 AC + - AMPc - + PKA Inactivated Activated IIb-IIIa IIb -IIIa complex VASP VASP-P complex No Fibrinogen binding PP Fibrinogen binding Resting Platelet Activated Platelet Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-7

Platelet VASP-FCM Biocytex • Mesure de la capacité de l’ADP à inhiber la phosphorylation de VASP • Principe • Marquage de VASP-P en immunofluorescence indirecte après fixation et perméabilisation • Analyse en double couleur

Principe du test Tube 1 Tube 2 Tube 3 10 µl de PGE1 10 µl sang citraté 10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté 10 µl de PGE1 +ADP 10 µl sang citraté Vortex – Incubation 10 min Fixation 10 µl Vortex – Incubation 5 min Perméabilisation cellulaire et immunomarquage 10 µl Ac anti-VASP-P 10 µlAc anti-VASP-P 10 µlContrôle isotypique Vortex – Incubation 5 min Révélation et contre-marquage plaquettaire 10 µlIg polyclonal –FITC – CD61 PE Dilution Lecture (2 h)

Analyse cytométrique • Protocole compensé GB Plaq Ac anti-VASP-P Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Isotype contrôle Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Positionnement de la fenêtre d’analyse Ac anti-VASP-P Condition PGE1 MFI Axe Y

Analyse cytométrique • Protocole Non Compensé GB Plaq Ac anti-VASP-P Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Isotype contrôle Condition PGE1 + ADP MFI Axe Y Positionnement de la fenêtre d’analyse Ac anti-VASP-P Condition PGE1 MFI Axe Y

Calcul de l’index de réactivité des récepteurs à l’ADP MFIc PGE1 – MFI c (PGE1 + ADP) X 100 MFIc PGE1

AVEC compensation SANS compensation Résultats préliminaires ns 100 ns 75 Index de réactivité plaquettaire 50 25 0 Normaux (n=5) Plavix (n=3) Mauvais répondeurs

Essais de répétabilitéProtocole non compensé

Essais de répétabilitéProtocole compensé

Application clinique • Mesure de la phosphorylation de VASP chez des patients traités par thiénopyridines ayant présenté ou non une thrombose artérielle sub-aiguë après ATCP • Groupe I (n =16): patients avec une thrombose de stent sub-aiguë • Groupe II (n=30) : patients sans complication thrombotique

Données démographiques

Résultats p < 0.0001 63.30% 70% 60% 39.80% 50% 40% 30% 20% 10% 0% No SAT SAT

Conclusion • Trousse aujourd’hui disponible et utilisable facilement • Indication : • suivi des traitements par thiénopyridines • Relevance clinique reste à confirmer

Marqueur VASP : aspects méthodologiques, validation technique