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Fermentative Production of Thymidine by a Metabolically Engineered Escherichia coli Strain

Fermentative Production of Thymidine by a Metabolically Engineered Escherichia coli Strain. 1 1硕：李思梦 导师：陈涛. 主要内容. 研究的目的与意义. 实验方法. 1. 2. 1.研究的目的与意义. 胸苷，即2-脱氧胸苷，由一分子2-脱氧核糖和一分子胸腺嘧啶组成，是多种抗病毒药物的前体，也是治疗AIDS的重要组成成分. 胸苷 C 10 H 14 N 2 O 5 242.23. 发酵法优点： 生产成本具有竞争力 ；

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Fermentative Production of Thymidine by a Metabolically Engineered Escherichia coli Strain

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Presentation Transcript

  1. Fermentative Production of Thymidine by a MetabolicallyEngineered Escherichia coli Strain 11硕：李思梦 导师：陈涛

  2. 主要内容 研究的目的与意义 实验方法 1 2

  3. 1.研究的目的与意义 • 胸苷，即2-脱氧胸苷，由一分子2-脱氧核糖和一分子胸腺嘧啶组成，是多种抗病毒药物的前体，也是治疗AIDS的重要组成成分 胸苷 C10H14N2O5 242.23

  4. 发酵法优点： 生产成本具有竞争力； 如果从无水葡萄糖开始合成胸苷，需要14步反应。因此，多步化学合成的方法使得胸苷的成本非常昂贵。（Japanese Patent Publication No. 39-16345，1964） 2.减少了化学合成工艺对环境的污染; 3.存在立体专一性. 作为抗病毒药物的前体，胸苷的生产通常有化学合成法和微生物发酵法。

  5. 胸苷生产菌株 黄色短杆菌 Brevibacterium helvolum 类似物抗性 226ug/ml 7天补料发酵6.5g/l 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 大肠杆菌Escherichia coli（在专利EP1190064B1中，产量达到6.8g/l左右） Satwinder K. Kalirai, Bernard Scanlon, Steve C. Taylor, 1 and Shamim I. Ahmad*J. Gen. Appl. Microbiol., 46, 217–224 (2000) EP0344937B1 EP0504279B1 EP1190064B1

  6. 为什么选择大肠杆菌 • 在E.coli中，完全是用的代谢工程的方法进行的菌种的改造，而黄色短杆菌是用诱变的方法进行的改造。 • 生长快、在工业应用方面有广泛的应用 • E.coli的基因序列完全清楚，基因操作技术在大肠杆菌中成熟，基因元件库多，可以做到对基因的精细调控，合成生物学的方法技术在大肠杆菌中也比较全面

  7. 2. 实验方法 • 由于胸苷涉及到DNA的合成，因此胞内的胸苷浓度很低，而且受到严密调控。 • 策略：加强胸苷合成的从头合成途径，敲除补救途径。　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

  8. 2. 实验方法 ×

  9. 途径介绍 • 途径从碳酸根与谷氨酰胺经氨甲酰磷酸合成酶（pyrA）合成氨甲酰磷酸，又经过天冬氨酸转氨甲酰酶（pyrBI）生成氨甲酰天冬氨酸，经二氢乳清酸酶（pyrC）生成二氢乳清酸，经二氢乳清酸脱氢酶（pyrD）生成乳清酸，与由pp途径生成的PRPP经乳清酸磷酸核糖转移酶（pyrE）生成乳清核苷酸OMP，经OMP脱羧酶（pryF）生成尿嘧啶核苷酸UMP，经UMP激酶（pyrH）生成UDP，经核苷二磷酸还原酶（nrd）生成dUDP，经核苷二磷酸激酶（ndk）生成dUTP，经脱氧尿苷三磷酸酶（dut）生成dUMP，经胸苷酸合成酶（thyA）生成dTMP，经TMP水解酶生成胸苷。

  10. E.coli产胸苷的研究现状 flask cultures for 24 h

  11. 阻断补救途径，首先敲除deoA（合成胸苷磷酸化酶），发现不能全完阻断胸苷的去路，接着敲除了tdk（胸苷激酶）与udp（尿苷磷酸化酶），发现有胸苷的合成了。阻断补救途径，首先敲除deoA（合成胸苷磷酸化酶），发现不能全完阻断胸苷的去路，接着敲除了tdk（胸苷激酶）与udp（尿苷磷酸化酶），发现有胸苷的合成了。 • 胸苷酸合成酶（thyA）是合成胸苷的非常重要的酶，过表达之后，胸苷的积累量增加了。同时 T4 nrdAB（核苷二磷酸还原酶）是被高度调控的酶，过表达之后，胸苷的产量增加了两倍。T4 nrdC是编码硫氧还蛋白的基因。 • 由代谢图看出，dUMP是胸苷的前体，dUMP的水平直接影响胸苷的产量，为增加dUMP的通量，表达了udk-dcd （尿苷激酶，dCTP脱氨酶）操纵子，但产量仅增加了30mg/l，可以看出应该还有另外的限速步骤。 • 提高TMP水解酶酶的酶活，发现dTMP水解为胸苷的效率才1.3pmol/mg.min，表达PBS2的TMPase，效率达到了16.6pmol/mg.min，胸苷积累量增加了1.5倍。

  12. T4核糖核苷酸二磷酸还原酶（nrdAB）操纵子，T4硫氧还蛋白（nrdC），T4胸苷酸合酶（td），PBS2 TMP磷酸水解酶（TMPase），大肠的dCTP脱氨酶（dcd），脱氧尿苷三磷酸酶（dut）和尿苷激酶（udk）

  13. 谢谢大家！

  14. Lee HC, Ahn JM, Lee SN, Kim JH (2004) Overproduction ofthymidine by recombinant Brevibacterium helvolumamplified with thymidine monophosphate phosphohydrolase gene from bacteriophage PBS2. Biotechnol Lett26:265–268 • Lee HC, Kim JH, Kim JS, Jang W, Kim SY (2009a) Fermentative production of thymidine by ametabolicallyengineered Escherichia coli strain. Appl Environ Microbiol 75:2423–2432 • Lee HC, Kim JS, Jang W, Kim SY (2009b) Thymidineproduction by overexpression NAD+kinase in an Escherichia coli recombinant strain. Biotechnol Lett 31:1929–1936 • Lee HC, Kim JS, Jang W, Kim SY (2010) High NADPH/NADP +ratio improves thymidine production by ametabolically engineered Escherichia coli strain. J Biotechnol 149:24–32 • Lee HC, Kim JS, Jang W, Kim SY (2011)Enhancement of thymidine production in E. coliby eliminating repressors regulating the carbamoylphosphate synthetase operon.Biotechnol Lett (2011) 33:71–78

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