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基因、基因體與 DNA PowerPoint PPT Presentation


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CHAPTER 4. 基因、基因體與 DNA. DNA 為遺傳物質的歷史回溯. 1828 年 Friedrich Wohler 證實了可用實驗室的化學藥品 ammonium cyanate 在試管中合成出尿素,是一種由動物產生的「活」的分子。這是第一次證明,其實沒有神奇的力量在生命體的化學物裡。

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基因、基因體與 DNA

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Presentation Transcript


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CHAPTER 4

基因、基因體與DNA


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DNA為遺傳物質的歷史回溯

  • 1828年Friedrich Wohler 證實了可用實驗室的化學藥品ammonium cyanate在試管中合成出尿素,是一種由動物產生的「活」的分子。這是第一次證明,其實沒有神奇的力量在生命體的化學物裡。

  • DNA是在1869由Frederich Miescher 感染傷口的膿中萃取物發現的。直到將近一百年後,才由Oswald Avery確認它的重要性。在1944年,Avery發現,利用化學萃取一些會引起肺炎的細菌株而得到的萃取物,可傳給其他類似但較無害的菌種,Avery純化這些必要的分子並證實它們就是DNA,即便他當時並沒有命名為DNA,因為DNA的結構還沒有被研究。

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  • James Watson 與Francis Crick 在1953年,提出著名的雙股螺旋模型,證實基因代碼的化學性質也介紹DNA複製的機制。1950年,Maurice Wilkins與他的同事Raymond Gosling拿到第一張DNA X-光繞射的圖。Rosalind Franklin加入了Wilkins的實驗室並繼續Gosling的工作。Watson 與Crick在1952年拿了Rosalind Franklin與Raymond Gosling的X-光繞射圖,並用以做為雙股螺旋模型的基礎。

  • 找出遺傳物質的化學基礎讓Watson、Crick與Wilkins在1962年贏得諾貝爾生理醫學獎,因為他們發現核酸的分子結構與活體基因訊息傳送的重要性。

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維持生命需要多少的基因訊息才足夠

  • 最小的真菌基因體是Mycoplasma genitalium,它有一個環狀的染色體,約有580,000個DNA鹼基對(bp)。一般一個基因的平均鹼基數目為1,000個鹼基,而在細菌中的非編碼DNA很少,約有500個基因。

  • 與其他小的細菌基因體比較,我們知道約有 250個基因是活細胞存在最基本的數目。最簡單的活細胞可能需要約200到300個基因。

  • 寄生的細菌,因為它並不能獨自生長,除非靠在其他微生物的表面。雖然有著較少的DNA,但它的基因較緊密且連續在一起,因此比M. genitalium有更多的基因代碼序列 ── 約550個。

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非編碼DNA

  • 真核細胞存有大量DNA是非編碼DNA (non-coding DNA)。也正如字面意義所指,這些DNA的鹼基序列是毫無意義的,就我們目前所知是沒有任何有用的基因訊息。

  • 任何區間的DNA,不管是否有基因代碼意義,都可視為是基因的地址(locus,複數為loci),也就是在染色體的位置 (或其他DNA分子上)。因為任何DNA的序列可能是一種形式,如果這段DNA是無基因代碼意義,則使用對偶基因(allele) 來代表。

  • 雖然細菌相對地只有很少的非編碼DNA,但真核細胞卻有著很大的量。高等真核細胞有較多量的非編碼DNA。

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  • 在原核細胞中,幾乎所有的非編碼DNA都是存在於基因與基因之間(intergenic DNA)。真核細胞的情形則較為複雜,不僅是非編碼DNA散落在染色體的基因間,基因本身也會被這些非編碼DNA給打斷。這些非編碼DNA叫作基因間區段序列(intervening sequence),也就是內含子(intron),而真正含有基因訊息的DNA就是外顯子(exon)。大部分真核細胞基因的外顯子間夾雜著有內含子。

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  • 為了要利用被干擾打斷的基因做成蛋白質,內含子必須被移走。轉錄之後在mRNA的層級,內含子在細胞核中被移除。當基因被表達時DNA首先被轉錄成一條很長的RNA分子,也就是說在主要的初級轉錄物(primary transcript) 時期仍有內含子存在,再來初級轉錄物經由處理移走內含子產生了mRNA 。

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非編碼DNA序列中也可能存在編碼DNA

  • 內含子並非完全不存在於原核細胞中,但是不尋常的是通常只有一個單一的內含子在一個基因上,並不像真核細胞中,有許多基因存在多個內含子。

  • 在一些少見的例子中,原核細胞染色體基因被打斷,但這些基因是RNA分子的代碼而非蛋白質的代碼。在真細菌與古細菌的tRNA 與rRNA的基因是在內含子中被發現。

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重複序列的DNA是較高等生物的特性

  • 大部分的基因都是以一組存在,而這些特殊的序列基因,幾乎就是所有細菌的DNA。但在高等生物體,這些特殊的序列,就可能只有全部DNA的20%。如人類有65% 的DNA為基因,蛙則有22%。剩下來的DNA都是重複序列(repeated sequences 或repetitive sequences)。重複序列就正如它們的名字一樣,在基因體裡重複出現。某些例子中,這些重複序列一個緊接著一個 (tandem repeat),但有些則是任意分散在基因體裡 (interspersed sequences)。這些重複序列有些是真正的基因,但大部分則是非編碼DNA。

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  • 這些重複序列家族的成員,每一個鹼基幾乎都是一樣的,可以視為是沒有什麼變化的,即便有也是非常微小的差異,也就是所謂的共同序列(consensus sequence)。要找到這樣的共同序列,就是比較許多的個別序列的鹼基,在每一個位置都找出最常出現的鹼基,並得到所有的平均。

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  • 真核細胞也有所謂的假性基因(pseudogene)。這些真正基因的複製拷貝是有缺陷的,而這些缺失使得它們無法被表達。

  • 有時基因的複製具有功能,而重複的拷貝可能產生一些相關基因的家族。這些重複的拷貝會逐漸分開,以或高或低的不同程度,來調節成相似的功能。因此這些重複序列形成非常相近但不是完全一樣的基因家族。

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  • 因為原核細胞有10,000個或更多核糖體,它們的DNA通常有六個複製本的rRNA和 tRNA基因。在更大的真核細胞,它們有上百上千個複製本的rRNA和 tRNA基因。這些存在於上百上千個複製本的序列,稱為中等重複序列(moderately repetitive sequence)。大約有25% 的人類DNA屬於這個種類。

  • 許多中等重複非編碼DNA序列,由LINEs所組成,也就是「長的重複非編碼DNA序列(Long INterspersed Elements, LINE)」。它們被認為是由類似逆轉錄病毒衍生而來。

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  • 10% 的人類DNA有上萬到百萬個複製本的序列,大多數的高等重複DNA序列(highly repetitive DNA) 包含SINE或短的重複非編碼DNA序列 (Short INterspersed Elements, SINE)。這些序列至今所知幾乎全是無功能的。最廣為人知的SINE是300個鹼基對的Alu因子(Alu element)。

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衛星DNA是非編碼DNA以重複序列出現

  • LINEs 和SINEs的定義是這些重複序列隨意分散在基因體上,但還有一種在真核細胞中數量不少的高等重複DNA序列,被發現以長的聚集存在,就是縱列重複序列(tandem repeats),也就是所謂的衛星DNA (satellite DNA)。Tandem的意義為這些重複序列在DNA上是以一個接一個的形態出現,中間並無任何的空間存在。衛星DNA的數量變化極大,在哺乳類如小鼠中約有8% 的DNA是衛星DNA,而在果蠅則將近有50%。

  • 長序列的縱列重複序列常有不正確的排列出現,當一對染色體在減數分裂做交換時會排列整齊,不相等的交換(unequal crossing over) 發生所產生一段重複序列的DNA較短,另一段重複序列的DNA較長 。

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  • 衛星DNA插入染色體,並緊緊的環繞在異染色質(heterochromatin) 上。異染色質位在染色體的中心體(centromere),推測它負責某些結構上的功能。但這些衛星DNA序列與中心體序列(centromere sequence) 是非常不同的,中心體是負責在細胞分裂中紡錘絲的附著。

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迷你衛星DNA與VNTR

  • DNA片段中包含著短的縱列重複序列,但比衛星DNA有較少的數目,這些就是迷你衛星DNA (mini-satellite) 或稱為不同數目的縱列重複序列VNTR (Variable Number of Tandem Repeat)。

  • 由於不相等的交換,在任一個VNTR的重複序列數目差異是極大的。雖然VNTR屬於無意義的沒功能的基因,但它的不同版本仍被視為對偶基因。

  • 一些高變異的VNTR可能有多至1,000個不同的對偶基因,並在個別生物體產生非常不同的形式。這種數量上的變異可能以DNA指紋(DNA fingerprinting) 分析來確認個體。

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自私DNA與垃圾DNA的起源

  • 一般認為在真核細胞染色體,發現的大部分重複與非編碼DNA是無用的,如此無用處的DNA,通常視為垃圾DNA (junk DNA)。它被認為是許多的重複序列與非編碼DNA,包括內含子,可能原先都由病毒DNA來的。當病毒DNA插入真核細胞染色體,逆轉錄病毒在產生這樣的染色體插入,扮演重要的功能。另外,轉位因子 (transposable element) ) 可能負責產生顯著數量的重複序列DNA。

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  • 重複序列DNA的產生可分為兩個過程,原始的序列可能是病毒DNA或轉位因子,這些序列插入染色體而仍舊維持不變及具功能性。兩樣元素都可能複製,而複製本則插入染色體中的許多不同部位,因此這些寄生物序列的數目就增加了,再加上許多序列會有突變,可能是鹼基改變或是刪除,這些結果造成一系列家族的序列,但大部分的功能性已不存在了。

  • 轉位因子因為只注重自身的存活與複製,並不會在任何方面幫助寄主,所以稱之為自私DNA (selfish DNA)。

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  • 自私DNA在基因體裡增長,可視為細胞的寄生物感染寄主的染色體。這些自私DNA的累積是靠著兩個相反的過程,複製與自私DNA的重新插入,再加上它自行產生的鹼基刪除。

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迴文、倒轉重複序列、莖狀與環狀結構

  • 迴文(palindrome) 的意思是一個字或句子,正著唸與倒著唸是相同的。在DNA的例子中,它是雙股螺旋,理論上兩種形式的迴文可被產生。如鏡子影像的迴文(mirror-like palindrome) 就像一般的文字,但牽涉到到兩條DNA。

  • 倒轉重複(inverted repeat) 序列的迴文是比較常見的,並具有生物功能的特殊意義。在倒轉重複序列,一個序列是正著唸與另一個互補序列倒著唸是相同的。

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  • 倒轉重複序列在蛋白質要接上DNA時的辨識序列是非常重要的,許多調控蛋白質可辨識倒轉重複序列,一些限制 與修飾酵素也可辨識倒轉重複序列。

  • 若以倒轉重複序列的單股來說,在每一股的右半段與左半段的序列,必須是互補的。如序列GGATATCC可被摺疊成髮夾(hairpin) 狀,兩端以鹼基配對結合而成 。

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少數幾個非配對的鹼基 (以N代表任何鹼基),在鹼基對的直桿上方會形成個圈圈,稱為莖狀與環狀(stem and loop) 結構。單股DNA的任何倒轉重複序列,只要具有多餘的幾個鹼基在中間,就可形成這樣的結構。

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多個A-tracts 造成DNA彎曲

  • DNA序列若包含幾個有A的鹼基 (連續3到5個核 酸長),並由10 bp間隔開來,就可形成彎曲。注意這些A-tract間的間隔,相當於雙股螺旋的一個轉折,彎曲發生在有As轉的3-端。彎曲的DNA (bent DNA) 在電泳分離時,會跑得比同樣長度但沒有彎曲的DNA來得慢。

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CHAPTER 4 基因、基因體與DNA


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超螺旋在細菌DNA的包裝上是必要的

  • 一般的細菌約有一百萬分之一公尺長,而一個攜帶4,000個或更多的基因的單一DNA分子,則有一毫米長。若將細菌染色體全拉開,將是一個細菌的一千倍長。在細胞內的雙股螺旋DNA必須是超螺旋(supercoiled) 狀,才能使得DNA更緊密。

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CHAPTER 4 基因、基因體與DNA


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  • DNA分子已是雙股螺旋,原先的雙股螺旋有著右手側扭轉,但超螺旋的扭轉是另一個方向,也就是左手側或「負向超螺旋(negative supercoils)」。在細菌DNA中,每一個超螺旋約有200個核 酸,在複製及轉錄時,負向超螺旋促使DNA螺旋解開,並幫助雙股分開。

  • 負向超螺旋是利用DNA促旋酶 (gyrase) 引進到細菌染色體的。若沒有拓樸酶I (topoisomerase I) 和拓樸酶IV (topoisomerase IV),DNA就會是極度的負向超螺旋。

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  • 在大腸桿菌的超螺旋程度是依據拓樸酶I和拓樸酶 IV間的平衡,拓樸酶IV的功能是輔助拓樸酶I的作用,而拓樸酶I的功能是可移走多餘的負向超螺旋,這樣的功能恰好與DNA促旋酶的作用相反。一般的細菌染色體,繞在蛋白質鷹架裡約有50圈大型DNA超螺旋。

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  • 細菌染色體和質體都是雙股環狀的DNA分子,並常稱為共價緊閉環狀DNA (covalently closed circular DNA或cccDNA)。如果雙股環狀的一股是有缺口,則超螺旋能被分開,這樣的分子為有缺口的環狀(open circle)。

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拓樸酶和DNA促旋酶

  • 在兩股扭曲DNA分子中所有的立體交叉處數目,稱為連接數(linking number (L)),這個是雙股螺旋加上超螺旋的總和。[雙股螺旋扭轉的數目,被認知為雙股螺旋轉(twist, T),而超螺旋扭轉的數目為超螺旋轉數目(writhe或writhing number, W)。至於linking number (L),就是twist的數目加上writhe的數目 (L=T+W)。]

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  • 相同的環形DNA,能有不一樣數目的超螺旋,這樣的異構物,稱為topological異構物,也就是拓樸異構體(topoisomers)。能將超螺旋加入或移除的酵素,因而稱為拓樸酶 (topoisomerase)。第一型拓樸酶(type I topoisomerase) 打斷的只有一股DNA,可以減少一個連接數。相反的,第二型拓樸酶(type II topoisomerase) [包括DNA促旋酶 (DNA gyrase)] 可打斷DNA的兩股,當兩股都打斷時,雙股DNA會經由斷裂處將雙股螺旋打開,而使得超螺旋的數目減少兩個 。

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  • DNA 促旋酶活性會被喹啉酮類抗生素(quinolone antibiotics) 抑制,如nalidixic acid、norfloxacin和 ciprofloxacin,它們會結合GyrA蛋白質而達到抑制的效用。當GyrA蛋白質插入DNA雙股螺旋,並以共價結合方式接上斷裂DNA的5'-端,就會形成沒有活性的複合物。novobiocin 也會以接上GyrB蛋白質而影響它與ATP的結合的方式,來抑制促旋酶的活性。

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鎖形與打結的DNA必須被校正

  • 環狀DNA分子在複製或重組時,可能會形成打結狀,如此的結構狀稱為鎖形(catenane) 狀的DNA。這樣的結構可以被特定細菌的第二型拓樸酶,如拓樸酶IV或相關的酵素解開。環狀DNA分子也可能成打結狀,第二型的拓樸酶可以同時產生或解開打結狀,就如同DNA 促旋酶,有兩個不同的單位形成四倍體,一部分負責剪開DNA,而另一部分負責結合能量。也像DNA 促旋酶、拓樸酶IV可被喹啉酮 (quinolone) 類抗生素抑制。

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局部的超螺旋

  • 當DNA在複製或基因在表現時,雙股螺旋首先會被打開,這是由於染色體的負向超螺旋的關係。當複製機器順著雙股螺旋的DNA移動,它會在它的前端產生正向的超螺旋。同樣的,在轉錄的時候,RNA聚合酶順著DNA分子移動,它也會在它的前端產生正向的超螺旋。為了使複製與轉錄能在距離稍長的前端進行,DNA促旋酶必須插入負向的超螺旋才能取消掉正向的超螺旋。在移動的複製與轉錄機器之後,就有一波負向的超螺旋產生,而多餘的負向超螺旋以拓樸酶I移除。

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拓樸異構體可以利用電泳分離

  • 任一個DNA分子,超螺旋的cccDNA移動較開放環狀的DNA分子移動得快, 而開放環狀的DNA就比線形分子移動得快。

  • 小型的環狀DNA分子,我們甚至可用電泳分離不同數目的超螺旋扭轉的拓樸異構體,數目愈多的扭轉數,結構愈緊密,因而在電泳裡也移動得比較快。

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超螺旋影響DNA的結構

  • 超螺旋可讓DNA處於物理緊張狀態,這會導致DNA的另類結構出現,這個另類結構可以舒緩DNA結構緊張。以下是這三種結構,十字形結構(cruciform structure);左手雙股螺旋(Z-DNA);另一個是三螺旋(H-DNA)。

    • 十字形結構:在雙股DNA(或RNA)因倒轉重複形成的十字形結構。

    • 三螺旋:一種形式的DNA有著三股螺旋,因酸性及purine鹼基轉而形成。

    • 左手雙股螺旋:另一形式的DNA雙股螺旋有左手轉及每一轉友12鹼基對。

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DNA的另類螺旋結構

  • Watson 與Crick的雙股螺旋稱為B-form或B-DNA,用來區分其他的螺旋態A-DNA與Z-DNA。

  • A-form的雙股螺旋比B-form 的較短及較肥大,每一個螺旋轉有11個鹼基對。

  • A-DNA是不常見的,雙股的RNA在in vivo是以這樣的形式存在。

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  • Z-DNA是左手轉的雙股螺旋,每一轉有12個鹼基對,它因此比B-DNA較長且窄細,它的磷酸糖骨架成鋸齒狀而非平滑的螺旋曲線。高鹽濃度傾向形成Z-DNA,因為它會降低DNA骨架上負電的磷酸根排斥,Z-DNA具有高數目的GC或 GT,對區域的DNA形成,如

    GCGCGCGCGCGCGC或GTGTGTGTGTGTGT

    CGCGCGCGCGCGCG或CACACACACACACA

    如此的序列可簡寫成(GC)n‧(GC)n和(GT)n‧(AC)n注意這樣的序列是以5' 到3' 的方向。

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  • Z-DNA是左手轉的螺旋,它的出現在DNA分子中可幫助解除超螺旋的緊張,當負向的超螺旋增加時,DNA中的GC-或GT- 形成Z-form 的機率會跟著增加,它在小質體中的存在可以用電泳結果的不同來展現。單股特定的核酸水解 能在Z-DNA與正常的B-DNA交接處切開。

  • 短的人工合成的雙股螺旋DNA,可以用單純的GC重複序列,在高鹽濃度下即便缺少超螺旋也可形成Z-form。亦可以用線形的 (GC)n 序列打入動物而產生針對Z-DNA的抗體,這些抗體能用來顯示在自然狀態的DNA中的Z-form螺旋部位,顯示它是高度超螺旋。

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  • 某些酵素被證實可以辨識特定的Z-helix的部位,如RNA編輯酵素 (RNA editing enzyme, ADAR1)。ADAR1代表adenosine deaminase (RNA) type I,它可以將adenosine上的胺基去除而成inosine。

  • H-DNA則更加奇特 ── 它不是一個雙股螺旋,而是個三股螺旋,主要依照其中的一股長的嘌呤 (purine) 及另一股的嘧啶 (pyrimidine);如

    GGGGGGGGGGGGGG或GAGAGAGAGAGAGA

    CCCCCCCCCCCCCCC或CTCTCTCTCTCTCTC

    當DNA具有高度的超螺旋,就需要這樣的兩個序列去形成H-DNA。

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  • 整個部位必須是具有鏡像迴文。H-DNA含有一個三股螺旋,其中有一股具有較多的嘌呤和兩股有較多的嘧啶,另外一個含有較多的嘌呤則被取代,並未形成配對。

  • 在H-DNA,腺嘌呤 (adenine) 與兩個胸腺嘧啶 (thymines) 配對,而鳥嘌呤 (guanine) 與兩個胞嘧啶 (cytosines) 配對。每一個例子中,一組的配對是正常的,另一個則接在邊側 (稱為Hoogsteen base pairs ── 也就是H-DNA)。再來要形成C=G=C三角形,其中一個氫鍵就需要一個多的質子 (H+)。也就是說,在酸的環境下較利於H-DNA的形成。強酸也傾向在DNA骨架的磷酸根上加上質子,以減少它們的負電荷。如此一來,三股之間的排斥力減少,因而有利於形成三股螺旋。

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真核細胞的組蛋白包裝DNA

  • 真核細胞的染色體並非環狀,因此需要以DNA 促旋酶來將DNA做超螺旋,可把DNA環繞著特殊蛋白質做扭轉並壓縮起來,這個特殊蛋白質就是組蛋白(histone)。

  • 真核細胞DNA的摺疊起始於環繞著組蛋白做螺旋轉,正電的組蛋白與負電的DNA可以互相中和。若DNA上有著組蛋白則這樣的化合物叫作染色質(chromatin),因為它首先在染色體被發現。Chromatin 包含有球形的單位,也就是核小體(nucleosome),每一個含有約略為200 bp的DNA及9個組蛋白,各有兩個H2A,H2B,H3和H4,以及一個 H1。

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  • 八個成對的組蛋白與兩個的螺旋轉DNA互相捲繞在一起。每一個螺旋轉DNA約有80 bp長,螺旋中心共可容納160 bp DNA。附近以約有40 bp長的序列形成一個接線 (linker) 連接到下一個螺旋中心,接線的長度變化很大 (從10到100 bp) 是取決於DNA序列。第九個組蛋白H1,負責將螺旋中心接上下一個。

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  • DNA在接線部分是暴露在外的,可以用雙股DNA特定的核酸水解酶來切開,這些核酸水解酶可以將雙股切開。實際上,微球菌 (micrococcal) 核酸水解酶可用來處理這類工作。切開可分為三個步驟,首先單個200 bp 的DNA 核小體會被釋放,接著接線部分被切除,留下約165 bp。最後,繞著螺旋中心的DNA尾端被拉開,約146 bp原先被保護好的DNA會經由更進一步的消化而去除。

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  • 中心的組蛋白,H2A,H2B, H3與H4都是小的,多為球形的蛋白質,有著102到135個胺基酸。而接線組蛋白,H1較長有著約220個胺基酸。H1有兩個胳臂從中心球體往外伸出,中心部分接上本身的核小體,而兩個胳臂則聯繫核小體的兩側。

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核心組蛋白有約80個胺基酸的本體,還有在N-端的尾巴有20個胺基酸。這個尾巴包含許多lysine可被乙醯化或去乙醯化 (acetylation) 。

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真核細胞更進一步的DNA包裝

  • DNA外包裹著組蛋白並扭轉成一系列的核小體,就像是一長串的珠子,也因此稱為”beads on a string” 。摺疊的過程持續進行,核小體鏈扭轉成巨大的螺旋結構,每一個螺旋有6個核小體。

  • 30奈米纖維(30 nanometer fiber)。這些纖維前後繞著圈子,這些圈圈的大小變化很大,平均每個圈約有50個螺旋轉 (約300個核小體)。這些圈圈的結尾連結著蛋白質骨架 (protein scaffold) 或染色體軸 (chromosome axis)。

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  • 高度壓縮染色質被認知為異染色質(heterochromatin),在光學顯微鏡下看來是緊密的,這樣的形式並無法做轉錄 。

  • 在細胞分裂期間,異染色質部分持續在中心體以及在染色體的盡頭。這些部分包括上述所提的衛星DNA,約為染色體的10%。剩下的染色質,也就是真染色質(euchromatin),是在一種較伸展的形式。

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  • 在兩次細胞分裂之間,大部分的DNA是壓縮的。它包含一個伸展的雙股螺旋DNA分子,完全不像一般常見的染色體照片。就在細胞分裂之前,DNA壓縮且摺疊起來,如同上述情況,一般的細胞分裂中期染色體,就像常見到的照片一樣,在這之前DNA已經複製,並準備分裂成兩個子染色體。因此它包含兩個完全相同的雙股螺旋DNA分子,但它們仍接在中心體上,這就是所謂的染色分體(chromatid)。

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高溫使得DNA雙股分開;冷卻使它們結合

  • 氫鍵相對來講是弱的,但因為一分子的DNA通常包含百萬個鹼基對,把所有百萬個弱的鍵結加起來,其力量就強化到可以使兩股結合在一起。當DNA被加熱,氫鍵開始被打斷,如果溫度夠高的話,兩股會分開。這就是「熔化(melting) 或變性 (denaturation)」。

CHAPTER 4 基因、基因體與DNA


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CHAPTER 4 基因、基因體與DNA


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  • 每個DNA分子根據其鹼基組成,有它自己的熔化溫度(melting temperature, Tm)。因此,DNA分子的熔化溫度,根據嚴格的定義是,在熔化曲線的中點。這比猜測在什麼溫度會有完全的熔化來得準確。

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  • 熔化溫度受到pH與溶液鹽濃度的影響,若要比較熔化溫度就必須標準化pH與溶液鹽的濃度。極端的pH會打斷氫鍵,而高鹼性的pH會將鹼基去中子,因而減少它們形成氫鍵的能力,在pH>11.3時,DNA會完全的熔化。相反的,非常低的pH會引起多重的中子化,進而影響氫鍵的形成。當DNA因pH而熔化,多用鹼性處理,因為鹼性不像酸性,它不會影響鹼基與去氧核糖上的糖鍵結形成。DNA在高離子濃度是相對的較穩定的,這是因為離子抑制靜電排定力來自在骨架上帶負電的磷酸根,使得它顯現穩定效果。在純水中,DNA甚至會在室溫下熔化。

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  • DNA分子若有較高比率的GC鹼基對,就有較高的熔化溫度。AT鹼基對比較弱,因為它們只有兩個氫鍵,而GC鹼基對有三個。加上,GC鹼基對與其鄰近的分子相容性比AT鹼基對來得高。在早期的分子生物學,熔化溫度是用來預估DNA樣品中GC對上AT的百分比。DNA鹼基的組成通常以GC比率(GC ratio) 來表示,GC量 (% G+C) 可用下列公式來計算:

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  • 當DNA分子熔化,有著局部高濃度的AT對會比較早熔化,而富有GC的部分就能維持久一些的雙股螺旋結構。

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  • 如果熔化的DNA分子的單股冷卻後,這個DNA單股將會以鹼基配對來辨識它的另一半,於是雙股DNA又會產生。這個稱為煉合(annealing) 或復性(renaturation)。

  • 適當的煉合條件,DNA必須緩慢冷卻以允許單股DNA找到它適當的另一半。再者,溫度應維持夠高,使得氫鍵在一個或數個鹼基的範圍可被隨意的打斷。在Tm溫度以下的20~25C通常是適當的選擇。如果DNA來自兩個不同但相關的來源,DNA會熔化再煉合回去時,雜交的DNA (hybrid DNA) 就會形成 。

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  • DNA與 / 或RNA的雜交(hybridization) 原先是在能很方便直接分析DNA序列之前,用來估算不同生物體的相關聯性,尤其是細菌這種DNA的量相對來說是小的生物體。雜交的另外用途包括偵測特定的基因序列與基因複製。

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