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Proteine che legano/trasportano l’ossigeno

Proteine che legano/trasportano l’ossigeno. Mioglobina ed Emoglobina. Sono state le prime proteine di cui e’ stata determinata la struttura tridimensionale (diffrazione a raggi X) Proteine essenziali per la conquista della vita aerobica e lo sviluppo di forme di vita molto complesse.

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Proteine che legano/trasportano l’ossigeno

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Presentation Transcript


  1. Proteine che legano/trasportano l’ossigeno

  2. Mioglobina ed Emoglobina • Sono state le prime proteine di cui e’ stata determinata la struttura tridimensionale (diffrazione a raggi X) • Proteine essenziali per la conquista della vita aerobica e lo sviluppo di forme di vita molto complesse. • Problema: l’ ossigeno molecolare ha una solubilita’ limitata nelle soluzioni acquose. Con la complessita’ degli organismi superiori si genera la necessita’ si trattenere e di trasportare ai vari tessuti l’ossigeno per permettere la respirazione (recupero energetico piu’ efficiente!)

  3. Mioglobina ed Emoglobina • La mioglobina e’ una proteina monomerica, compatta e globulare di 153 aa e con un peso molecolare di 16,7 kDa. • Contiene un gruppo eme legato • E’ una proteina di stoccaggio dell’ ossigeno • E’ molto abbondante negli animali che fanno frequenti immersioni (balene, etc) • L’emoglobina e’ invece un tetramenro di globine, strutturalmente simili alla mioglobina. • Ogni globina contiene un gruppo eme legante una molecola di O2

  4. Emoglobina • 4 catene polipeptidiche • 2 catene  • 2 catene  • Ogni catena ha un gruppo eme, mostrato in rosso

  5. Eme • Struttura ciclica costituita da 4 anelli pirrolici e contenente un atomo di ferro centrale contraente 4 legami di coordinazione con il tetrapirrolo. Le rimanenti 2 posizioni di coordinazioni sono occupate da una istidina della globina e dalla molecola trasportata. • Conferisce al sangue il caratteristico colore

  6. Eme: formula di struttura • L’ ossigeno non lega efficientemente nessuno dei 20 aminoacidi, mentre lega bene i metalli • Il ferro non si trova mai allo stato libero nei sistemi viventi, ma sequestrato dalla protoporfirina IX (anello tetrapirrolico con legami metenici) • Notare le due posizioni di coordinazione libere

  7. Il legame dell’ ossigeno all’ eme • La protoporfirina IX contenente un atomo di ferro coordinato e’ chiamata eme • Il ferro puo’ esistere in due stati di ossidazione, +2 (ferroso) e +3 (ferrico) • L’ ossigeno puo’ legarsi solo all’ eme Fe+2 • Nell’ eme libero l’ossigeno legandosi ossida il ferro dando luogo alla ematina.

  8. Effetto della struttura proteica sul legame all’ ossigeno • Il legame dell’ ossigeno all’eme e’ fortemente influenzato dalla struttura della proteina. • L’ossigeno si lega in una cavita’ tra una valina ed una fenilanalina. • Il CO puo’ legare l’eme, piu’ di 20000 volte piu’ efficientemente dell’ossigeno (solo 200 volte se l’eme e’ legato alla emoglobina!), e con un angolo diverso. • L’ istidina distale lega l’ossigeno (e non il CO) distorcendo il legame e rendendolo piu’ instabile. L’emoglobina funzionada trasportatore proprio grazie a questa instabilita’ del legame, che e’cosi’reso reversibile. Il legame con il monossido di carbonio e’ invece irreversibile. Istidina distale Istidina prossimale

  9. Stati della struttura quaternaria della emoglobina: • Dessiemoglobina, stato T, bassa affinita’ per l’ossigeno • Ossiemoglobina, stato R, alta affinita’ per l’ossigeno

  10. Deossiemoglobina • Contiene CO2 • Eme in verde • Stato T (teso)

  11. Ossiemoglobina • E’ caricata completamente di ossigeno (4 molecole) • Eme in verde (cambio struttura) • Stato R (rilassato)

  12. Cambio conformazionale T-R: effetto sull’ eme Stato T: eme non planare; Stato R: eme planare

  13. Cooperativita’ dell’ emoglobina: • Una subunita’ trasmette informazioni alle altre • Una volta che la prima molecola di ossigeno si lega le altre si legano piu’ facilmente • L’ effetto cooperativo e’ dovuto ad un effetto allosterico

  14. Cooperativita’ Il legame dell’ ossigeno di una subunita’ della Hb, INCREMENTA la affinita’ delle altre subunita’ per altre molecole di ossigeno. In altre parole il primo legame e’ il piu’ difficile, gli altri via via facilitati Esempio: il distacco di 4 francobolli Per separare il primo si devono rompere 2 lati, per il secondo ed il terzo 1 solo, mentre il terzo e’ automaticamente libero

  15. Le modifiche strutturali: T versus R

  16. La regolabilita’ e’ caretteristica della sola emoglobina • La mioglobina e’ un monomero------No allosterismo. • L’ emoglobina e’ un tetramero (a2b2)------ e’ l’esempio piu’ classico di proteina dotata di regolazione allosterica

  17. Regolatori allosterici • Esempi: • il legame dell’ O2 favorisce l’ulterione legame dell’ O2 • il 2,3-BPG (2-3-bisfosfoglicerato) favorisce il rilascio dell’ O2 • la CO2 (o l’ abbassamento del pH) favoriscono il rilascio di O2

  18. b a Equilibrio tra forma T e forma R b O2 a H+,CO2,BPG R (alta affinita’) T (bassa affinita’)

  19. La biosintesi di 2-3 bisfosfoglicerato: Il 2-3 BPG e’ un “intermedio” della glicolisi che viene normalmente sintetizzato in quantita’ stechiometriche in quanto viene utilizzato come “scambiatore” da un enzima della via glicolitica, la mutasi che sposta il gruppo fosforico dalla posizione 3 alla 2 dell’ acido fosfoglicerico.

  20. Perche’ il legame dell’ ossigeno all’ emoglobina e’ regolato? Perche’ le necessita’ e’ la disponibilita’ di ossigeno differiscono nei tessuti Legame O2 Rilascio O2

  21. Plot di Hill Y log(Y/1-Y) 0.5 log P50 pO2 (torr) log pO2 P50 (K) La curva di saturazione della mioglobina: • Il legame reversibile dell’ ossigeno alla mioglobina: pendenza=1 0.0

  22. La curva di saturazione della emoglobina: • Il legame reversibile dell’ ossigeno per i 4 siti della emoglobina: Plot di Hill Y log(Y/1-Y) pendenza=4 0.5 0.0 log P50 pO2 (torr) P50 log pO2

  23. Nei tessuti O2 si dissocia dalla Hb O2 si lega alla Hb CO2 vine rilasciata Nei polmoni Effetti allosterici di H+ e CO2 sulla emoglobina • H+ promuove la dissociazione dell’ O2 dalla Hb. E’ un effettore eterotropico negativo. Alla diminuzione del pH e’ dunque associata la liberazione di O2 da Hb. Questo fenomeno e’ detto Effetto Bohr. • Anche la CO2 promuove la dissociazione di O2 da Hb. La CO2 agisce sulla Hb attraverso la generazione di H+: • Alcune molecole di CO2 legano direttamete Hb nella forma di carbammato (-NHCOO-) e causano la stabilizzazione dello stato T di Hb.

  24. Livello O2 in sangue arterioso Livello O2 in sangue venoso Effetto Bohr: 7.4 7.0

  25. Effetto del BPG: Il BPG e’ il principale responsabile della cooperativita’. L’altitudine incrementa la sintesi di BPG, incrementando la cooperativita’ e spostando la curva ulteriormente verso destra

  26. Adattamento a basse pO2: La via piu’ rapida e’ l’incremento della sintesi del BPG, piu’ efficiente dell’ aumento della sintesi di Hb. Questo concetto e’ importante anche nelle emoglobinopatie che causano anemia.

  27. Effetti allosterici del 2,3-Bisfosfoglicerato (BPG) sulla Hb • BPG promuove la dissociazione dell’ O2 dalla Hb. E’ dunque un effettore eterotropico negativo (ma incrementa la cooperativita’). BPG e’ carico negativamente e lega un sito carico positivamente nella Hb. • La inibizione esercitata dall’ BPG e’ imporatante per il rilascio di O2 nei tessuti.

  28. HbF • La emoglobina fetale HbF, che consiste in 4 subunita’ α2γ2, ha una affinita’ per l’O2 piu’ alta di HbA e A2 proprio a causa della sua piu’ bassa affinita’ per il BPG. Questo e’ ovviamente una caratteristica importante della HbF che le permette di caricarsi di ossigeno anche in ambienti pon pO2 molto piu’ basse che nei polmoni. Nella placenta materna infatti la HbA cede a HbF l’ ossigeno.

  29. polmoni versus tessuti distali • Polmoni rapporto O2:BPG alto pH 7.4 Ossiemoglobina favorita (O2 caricato) • Tessuti distali rapporto O2:BPG basso pH 7.0, C02 Deossiemoglobina favorita (O2 scaricato per la respirazione dei tessuti)

  30. Effetto Bohr – CO2 • La CO2 decrementa indirettamente il pH negli eritrociti • CO2 + H2O  HCO3- + H+ Reazione catalizzata dalla anidrasi carbonica per aumentare la solubilita’ della CO2 per il trasporto nel plasma (solo una piccola aliquota e’ trasportata dalla emoglobina stessa)

  31. Effetti addizionali della CO2 • Alcune molecole di CO2 legano l’ N-terminus della Hb e formano carbammati

  32. Effetto dell’ abbassamento del pH: • L’ abbassamento del pH favorisce il rilascio di ossigeno • Abbassamanto del pH  protonazione dei residui di Hb • L’Hb si comporta come un sistema tampone negli eritrociti • La protonazione causa legami addizionali tra le subunita’che stabilizzano la forma T (deossiemoglobina)

  33. Perche’ la mioglobina nel muscolo? • In condizioni di riposo la saturazione dei siti per O2 e’ completa (per l’emoglobina no) • piccoli cambiamenti di pO2 e di pH ( e nei muscoli ce ne sono continuamente) hanno piccoli effetti sulla % di saturazione • Durante un esercizio vigoroso il cuore pompa il sangue velocemente ed il ritmo respiratorio incrementa per aumentare l’ apporto di O2 . Inoltre il pH e’ abbassato per il metabolismo incrementato (aumenta la produziome di C02). • Se il trasporto non soddisfa il fabbisogno e’ necessario un accumulatore di O2: la MIOGLOBINA. • Fibre rosse: mioglobina e metabolismo aerobio (mitocondri) contrazione lenta e prolungata Fibre bianche: no mioglobina, no mitocondri e metabolismo anaerobio, contrazione rapida ma non prolungata.

  34. Metabolismo degli eritrociti: • Glicolisi • 90-95% del consumo di glucosio degli eritrociti • Il glucosio entra per diffusione e viene metabolizzato a lattato • Due molecole di ATP/mole di glucosio • ATP necessario per la forma la flessibilita’ e la integrita’ di membrana • Ciclo dei pentosi fosfati • Produce NADPH e glutatione (GSH) ridotti • Il GSH protegge le cellule dallo stress ossidativo • Ruolo chiave: mantiene la Hb nello stato ridotto, evitando la formazione di Metaemeoglobina (HbM) con Fe3+ che non puo’ legare O2 perche la sesta posizione di coordinazione e’ occupata dall’ H2O.

  35. Segue: • Metemoglobina reduttasi • Pathway che mantiene il ferro allo stato ferroso (Fe2+) • Dipende da glutatione, vitC e enzimi quali la glutatione perossidasi • Ruolo chiave: previene la ipossia • Rapoport- Luebering Shunt • Causa l’ accumulo di 2,3 BPG • Enzima chiave: DPG-sintetasi • Ruolo chiave: influenza l’ affinita’ dell’ ossigeno per la Hb

  36. La detossificazione dei ROS (specie reattive dell’ossigeno) e’ una attivita’ significativa degli eritrociti: + O2- Met Hb(Fe3+) La emoglobina aggrega e precipita nei cosiddetti corpi di Heinz Hb(Fe2+) O2 Visibili al microscopio

  37. Eritrociti con corpi di Heinz:

  38. 6-fosfogluconolattone Glucosio-6-PO4 Glucosio-6-PO4 DH + O2- Met Hb(Fe3+) NADP+ NADPH Glutatione reduttasi O2- NADH NAD+ MetaHb reduttasi SOD GS-SG 2GSH H2O2 2H2O + O2 Glutatione perossidasi Fe2+ Fe3+ OH Perossidi lipidici Ossidazione proteine Eliminazione ROS Hb(Fe2+) O2 formazione danno eliminazione ripaazione p.97 (no DNA)

  39. z2 yz1 ya2 ya2 a2 a1 q1 Chromosoma 16 a - like Genes yb1 e g g d b G A b - like Genes Chromosoma 11 Kilobasi 0 10 20 30 40 50 60 Hb Gower 1 ( z2 e2 ) EMOGLOBINE Hb Gower 2 ( a2 e2 ) Hb F ( a2 g2 ) Hb A2 ( a2 d2 ) Hb A ( a2 b2 ) Hb Portland ( z2 g2 ) PERIODO DI SVILUPPO Embryonic Fetal Adult Organizzazione cromosomica dei geni delle globine

  40. FAMIGLIE STRUTTURALI Hb Alpha - a1, a2 – emoglobine dell’ eta adulta HbA1, HbA2. z – emoglobine embrionali Hb Gower 1 e Hb Portland. q - (theta) appena scoperta e di funzione ignota Beta - b - HbA1. d - HbA2. g - HbF. e - Hb Gower 1 e Hb Gower 2

  41. EMOGLOBINOPATIE

  42. Emoglobinopatie e talassemie • Causate da mutazioni nelle globine • Talassamie- alterata velocita’ di espressione dei geni delle globine • Emoglobinopatie: anomalie strutturali delle catene globiniche

  43. Anemia a cellule falciformi: • E’ stata la prima patologia molecolare identificata • Eritrociti falciformi: danni tissutali ed anemia • Causa = singola mutazione puntiforme Glu  Val

  44. Anemia a cellule falciformi • La Val si trova sulla superficie della globina β della Hb • Nella deossiHb la Val interagisce con alcune parti idrofobiche di altre molecole di Hb • Aggregazione di deossiHb  deposizioni di fibre eliciformi • La deposizione di fibre e’ la causa della anemia e la forma degli eritrociti contenenti fasci di fibre precipitate e’ falciforme (vedi dopo)

  45. Figure La deposizione delle fibre nella HbS

  46. Eritrociti normali ed eritrociti con HbS

  47. Talassemie • Disordini ereditari che possono risultare in anemie la cui gravita’ va da moderata a severa • Il difetto consiste in una ridotta produzione di alcune catene della globina. • Sono MOLTO frequenti

  48. Demografia delle Talassemie • Trovate frequentemente nel Mediterraneo, Africa, Sud Asia, India • Distribuzione parallela a quella del plasmodio della malaria (fitness aumentata per lo stato eterozigote, che non viene selezionato negativamente, ma addirittura positivamente • → ecco la spiegazione della alta diffusione)

  49. Classificazione e terminologia delle talassemie • Portatore silente • Minima • Minor • Intermedia • Major

  50. SimbolismoAlpha Talassemia • Lettera greca:  /: indica la divisione tra gli alleli ereditati dai due genitori. / genoma corretto -/ delezione o mutazione in un gene • Ogni cromosoma 16 porta 2 geni. Il numero totale degli alleli per ogni globina e’ 4, 2 materni e due paterni

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