Introduction – Thérapie génique

2. Introduction – Thérapie génique José CORTES 09/09/2004

3. Mise au point d’une technique de cartographie à haut débit des sites d’intégration d’un vecteur rétroviral José CORTES 09/09/2004

4. Cependant 2 enfants ont développé une Leucémie Introduction – Essai clinique d’Alain FISHER 11 enfants atteints de X-SCID José CORTES 09/09/2004

5. L’équipe de Bushman Virus HIV-1 : Intégration préférentielle au niveau de gènes transcriptionnellement actifs L’équipe de Burgess Vecteurs HIV-1 : Intégration préférentielle à l’intérieur de l’unité transcriptionnelle. Vecteurs MLV : Intégration préférentielle aux alentours du +1 de la transcription . Introduction – Etudes des sites d’intégrations (1) José CORTES 09/09/2004

6. ADN génomique Vecteur ou Virus Digestion enzymatique (site de coupure fréquent) Ajout d’adaptateurs PCR Nested PCR Clonage et séquençage Introduction – Etudes des sites d’intégrations (2) Technique utilisée : José CORTES 09/09/2004

7. Introduction – Objectif de mon stage Réalisation de la technique José CORTES 09/09/2004

8. NlaIII 5’ 5’ Côté Reverse Site d’insertion du vecteur PVI MmeI Partie Vecteur catg Séquence à analyser PLI3 Côté Universel Séquence cible de l’insertion schéma d’un contig réalisé par le logiciel BioEdit Résultats– 1ère partie (1) Analyse des jonctions vecteur-ADN génomique José CORTES 09/09/2004

9. Résultats– 1ère partie (2) 211 clones bactériens séquencés José CORTES 09/09/2004

10. 182 jonctions Résultats– 1ère partie (2) Sur 117 jonctions positionnables sans ambiguïté, 111 jonctions sont différentes. José CORTES 09/09/2004

11. Positions des insertions détectées sur leurs chromosomes respectifs D’après le site http://genome.ucsc.edu Les traits rouges représentent la position des intégrations détectées Les chromosomes encadrés en rouge n’ont subit aucune modification par le vecteur Résultats– 1ère partie (3) José CORTES 09/09/2004

12. Résultats– 1ère partie (4) José CORTES 09/09/2004

13. NlaIII 1 2 5’ 100 pb 5’ MmeI Digestion par MmeI 58 pb NlaIII 5’ 5’ MmeI NlaIII Ligation LN2 20 pb NlaIII NlaIII 100 pb MmeI 1 2 bPLI 102 pb bPLN PCR bPLN/bPLN 44 pb Digestion NlaIII 30 pb NlaIII NlaIII Résultats– 2ème partie (1) José CORTES 09/09/2004

14. 1 2 3 4 NlaIII 5’ 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII 100 pb 5’ 5’ MmeI NlaIII Ligation LN2 NlaIII NlaIII MmeI bPLI 20 pb bPLN PCR bPLN/bPLN 1 : PCR bPLN/bPLI 3 : Purification sur billes Digestion NlaIII 2 : Fragment digéré par NlaIII 4 : Fragment de 26 pb purifié Puits n°4 NlaIII NlaIII Résultats– 2ème partie (1) José CORTES 09/09/2004

15. NlaIII 5’ 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII 5’ 5’ MmeI NlaIII 500 pb 1000 pb Ligation LN2 NlaIII NlaIII région 600-1200 pb MmeI bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN Digestion NlaIII NlaIII NlaIII Résultats– 2ème partie (1) José CORTES 09/09/2004

16. NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII NlaIII Résultats– 2ème partie (2) Analyse des concatémères José CORTES 09/09/2004

17. Résultats– 2ème partie (3) Étiquettes obtenues : Sur 40 séquences de concatémères, 1002 étiquettes on été extraites. Moyenne de 25 étiquettes par concatémère José CORTES 09/09/2004

18. Résultats– 2ème partie (4) Comparaison des étiquettes sur le génome José CORTES 09/09/2004

19. Résultats– 2ème partie (5) Comparaison des étiquettes sur le génome José CORTES 09/09/2004

20. Résultats– 2ème partie (5) José CORTES 09/09/2004

21. Conclusion Objectif atteint 211 séquences -> 111 jonctions différentes sur le génome 40 séquences de concatémères -> 207 étiquettes différentes, positionnables sans ambiguïté sur le génome José CORTES 09/09/2004

22. Remerciements Olivier DANOS Équipe Ciblage Javier PEREA Nathalie HOLIC-BARLET Julie MANTOVANI Service Séquençage Sabine Dubus Service Informatique Kelly MARTINEZ Aux Généthoniens… José CORTES 09/09/2004