TECNICAS DE ESTUDIO Silvia Juliana Serrano Gómez B.Sc, M.Sc

1. TECNICAS DE ESTUDIO Silvia Juliana Serrano Gómez B.Sc, M.Sc Fundación para la Investigación Clínica y Molecular Aplicada del Cáncer - FICMAC

2. Que es genotipificacion? • Genoma: “Set completo de información genética encontrada en una célula. En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas” • Alelo: “Diferentes formas o variantes de una gen” • Genotipo: “Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por un individuo” Genotipificación Determinación del genotipo de una persona

3. Metodos REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) • Amplificación enzimática de un fragmento de DNA • (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

4. Eventos en la Replicación del DNA: • Apertura de las cadenas (origen de replicación) • Colocación de los iniciadores (primers de RNA) ( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.) • Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores) • Eliminación de los iniciadores de RNA. • Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa)

5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • Componentes • Desoxinucleotidos (dNTPs)  dATP, dTTP, dGTP, dCTP • Enzima  Taq (Thermusaquaticus) • Iniciadores (Primers)  Complementarios a la cadena de ADN • ADN molde  Concentracion de 20ng

6. Desoxinucleotidos (dNTPs) Bases Nitrogenadas del ADN Union por puentes de hidrogeno Adenina-Timina Guanina-Citocina

7. ADN polimerasa Estable a altas temperaturas Enzima de 95kd. Actividad Exonucleasa: 5’—3’ Thermus aquaticus Thermococcus litoralis Actuar altas temperaturas

8. PRIMERS(Iniciadores, Cebadores) Dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Únicos: Asegura alta especificidad: 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Características importantes Únicos Tamaño Dimeros de primers 5’ La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento

9. Tamaño • Efectos en: • Carácter de único • Mas tamaño (15pb) • Temperaturas de anillaje (ºTm) • La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)

10. OJO con los dimeros de primers

11. Denaturación 100 94 oC 94 oC Extension 72 oC 50-60oC Temperatura 50 Anillaje 0 Tiempo Etapas de la PCR Denaturación: Apertura de la doble cadena Alineamiento: Anillaje de primers Extensión: Generación de la nueva cadena 30 ciclos Denaturación

12. Animación Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

13. 1 2 4 8 16 32 64 2 0 1 5 6 3 4 El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR. Numero de copias Numero de ciclos

14. ElectroforesisRevelado Separación de moléculas en un campo eléctrico Electrodo (+) Cámara de electroforesis Camas para preparación del gel de agarosa Fuente de poder Electrodo (-)

15. Agarosa y su preparación Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en función del peso molecular

16. Agarosa Calentar Mezclar agarosa con una solución tampón como el TBE (tris-ac. Borico-EDTA)

17. Tinción con Bromuro de etidio Agente intercalante Bromuro de Etidio Molécula fluorescente que se intercala entre la s bases de la molécula de DNA Absorción a 330 nm (UV)emisión en luz visible

18. Factores que afectan la velocidad de migración 2. CONFORMACION DE LA MOLECULA 1. TAMAÑO DEL FRAGMENTO la velocidad de migración del fragmento es inversamente proporcional al log del nº de pares de bases ADN Lineal ADN circular

19. 4. CONCENTRACIÓN AGAROSA Inversamente proporcional a velocidad de corrido 3. VOLTAJE APLICADO La velocidad de migración es proporcional al voltaje aplicado 2% 1.5% 1% 0.5%

20. Interpretación de electroforesisMarcador de peso molecular 1.Permite identificar tamaño de fragmentos 50pb 25pb 100pb

21. Ejemplos de corridos de electroforesis Con marcador de 100pb Con marcador de 50pb M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 5 6 7 400pb 300pb 250pb 150pb 100pb 400pb 350pb 300pb 250pb

22. Bandas Inespecíficas Corrido de electroforesis con bandas inespecíficas Bandas definidas con diferentes pesos moleculares

23. Interpretación de electroforesisCalidad del ADN Buena Calidad de ADN Diferentes calidades de ADN 1 2 3 4 CP CN 1 2 3 4 5 6 CP CN CP: Control Positivo CN: Control Negativo 1-6: Pacientes CP: Control Positivo CN: Control Negativo Pozo 2  No ADN Pozos 3 y 4  Bajas concentraciones

24. Técnicas derivadas/ basadas en PCR • PCR Nested :Amplificación de una secuencia dentro de otro previamente amplificada • PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma simultánea • PCR-RFLP :Polimorfismo genético • RT-PCR : Detección de mRNA • Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en tiempo real

25. PCR Nested (anidada)Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers 1 Reacción Primers externos para amplificación de una secuencia extensa 2 Reacción Primers internos para amplificación de una región especifica SEGUNDA PCR Genera mayor ESPECIFICIDAD

26. PCR Multiplex • Amplificación de varias secuencias de forma simultanea • Diferentes set de primers • Ojo Tamaño del amplicon APLICACIONES Ensayos de deleciones Amplifica exones Ensayos forenses Biomarcadores polimórficos Ensayos microbiológicos Cepas y especies

27. RFLPsRestriction fragment length polymorphism METODOLOGIA Extracción de ADN PCR – se obtiene la secuencia target Digestión con enzimas de restricción  mecanismo de defensa de bacterias Electroforesis en gel • Estudios de polimorfismos: variación en la secuencia de ADN

28. Cambios en el sitio de restricción Person A 5' 3' GGCC GGCC GGCC GGCC Person B 5' 3' GGTC GGCC GGCC GGCC

29. Cambios en el sitio de restricción Hae III corta: 5’ GGCC 3’ 5' 3' GGCC GGCC GGCC GGCC CC GG CC GG CC GG 5' 3' GGCC GGCC GGTC GGCC CC GG CC GG

30. ADN Normal ADN silvestre ADN Normal A B C B+C A B C C ADN Mutado B A A A B+C

31. PCR en tiempo real (RT-PCR) • La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de los productos en un solo tubo. • “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generando • Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes UTILIDADES - Genotipificación - Cuantificación de carga viral - Cuantificación del numero de copias de un gen - Expresión génica (RNA)  Retrotranscripción

32. Componentes RT-PCR

33. PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real PCR tradicional Preparación de la Muestra Amplificación Detección PCR en Tiempo Real Preparación de la Muestra Amplificación y Detección

34. Sistemas de DetecciónUso de moléculas fluorescentes No-Específico • SYBR Green I • Molecular fluorescente que se unen a ADN • Emisión a 520nm DESVENTAJAS Inespecífico

35. Curva de Melting PRODUCTOS ESPECIFICOS

36. Curva de melting Productos específicos tiene un mayor °Tm

37. Sistema de Detección Específico TaqMan Uso de “secuencia especifica de oligonucleotidos” - Reportero 5’: Emite fluorescencia - Quencher 3’: Bloquea emisión de fluorescencia Actividad 5’ nucleasa Separación reportero-quencher

38. Sistema de Detección EspecíficoMolecular Beacon Probes Secuencia de la sonda Stem Quencher Fluoroforo

39. Molecular BeaconProbes

40. Sistema de Detección EspecíficoScorpionsprobe 1. Hibridación del primer a una secuencia target Loop 2. Extensión de la polimerasa formando un producto de PCR Stem Bloqueador Quencher Primer Fluoroforo

41. 4. Fase de anillaje  Cambio conformacional del loop 5. Hibridación

42. Cinética de la PCR • Exponencial: Duplicación exacta del producto  se acumula en cada ciclo. • Lineal: Componentes consumidos, productos empiezan a degradarse. • Plateau: Reacción se consume y no se generan más productos.

43. Plateau Fase logarítmica CT (CP) UMBRAL Número de ciclos Fluorescencia Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR Green y Sondas de Hibridación (determinado automáticamente por el instrumento). CT (CP): Número de ciclo en donde la fluorescencia supera el umbral.

44. 1 2 3 4 5 …El CTdepende de la concentracióninicial de ADN! A > CT < [ ADN inicial ] A < CT > [ ADN inicial ] 10 ng = CT 18 1 ng = CT 21 100 pg = CT 25 10 pg = CT 28 Blanco

45. mRNA PCR cDNA RT-PCR (Retro-transcripción) Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa Primers:- Hexameros al azar - OligodT Enzima Taq polimerasa

46. SECUENCIACIÓN

47. Mezcla de reacción

48. Secuenciación de Sanger • Reacción de PCR • Uso de: • Dideoxinucleotidos • Deoxinucleotidos dNTPs

49. La Reacción con ddATP 3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’ 5’TTATCGTA 5’TTATCGTACCA 5’TTATCGTACCATGA 5’TTATCGTACCATGACTA 5’TTATCGTACCATGACTAGA 5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA 8pb 11pb 14pb 17pb 19pb 25pb 5’TTATCGTA 5’TTATCGTACCA 5’TTATCGTACCATGA 5’TTATCGTACCATGACTA 5’TTATCGTACCATGACTAGA 5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA

50. ddATP ddCTP ddGTP ddTTP Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope Separación de Fragmentos INTERPRETACION DEL GEL AGTACTTATGCAGGTCACGTGCA