1 / 22

Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria .

Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie. Fluoryzujące pochodne i analogi puryn, stosowane w badaniach enzymologicznych (przykłady).

tamarr
Download Presentation

Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym: jeszcze raz fototautomeria .

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Fluorescencja 8-azaksantyny i jej pochodnych w środowisku wodnym:jeszcze raz fototautomeria. Jacek Wierzchowski Katedra Fizyki i Biofizyki UWM w Olsztynie

  2. Fluoryzujące pochodne i analogi puryn, stosowane w badaniach enzymologicznych (przykłady). • 2-aminopurynaN1,N6-etenoadenozynaformycyna A8-azaguanina • lmax ~ 360 nm lmax ~ 410 nm lmax ~ 340 nm lmax ~ 390 nm • ~ 0.6= 0.55= 0.08~ 0.08 ÷ 0.3 • Najważniejsze zastosowania: • Badania oddziaływań enzym-ligand oraz asocjacji białek, polinukleotydów itd. • Badania dynamiki DNA i RNA • Fluorymetryczne oznaczanie aktywności enzymów

  3. Czy 8-azaksantyna fluoryzuje? Deaminaza guaninowa (GDA) działa na 8-azaguaninę, produkując 8-azaX: Gdyby produkt fluoryzował, mielibyśmy metodę oznaczania aktywności GDA. Enzym ten jest ważny klinicznie - stanowi marker zakażenia HCV! • Inne możliwe pożytki z fluorescencji 8-azaX: • Badanie oddziaływań z oksydazą ksantynową. • 8-azaX to silny inhibitor urykazy (enzym utleniajacy kwas moczowy). • Pochodne metylowe – analogi kofeiny, teofiliny etc. to potencjalne ligandy dla receptorów adenozynowych. • Pierwsze podejście: produkt deaminacji 8-azaguaniny nie fluoryzuje

  4. Własności kwasowo-zasadowepuryni8-azapuryn. Albert, A.Chemistry of 8-azapurines. Adv. Heterocycl. Chem. 1986, 39, 117-178.

  5. Czy forma obojętna 8-azaX (pH < 5) fluoryzuje?TAK!!ale… (▬▬), absorpcja w pH 2; (▬ ▬), absorpcja w pH 7; (○○○), wzbudzenie fluorescencji w pH 4; (●●●), fluorescencja w 1 mM HCl; (++++), fluorescencja w metanolu.

  6. Tautomeria formy obojętnej 8-azateofiliny: L’abbe G., Persoons M-A., Toppet S. Magn. Res. Chem. 25 (1985), 362-4. Sanchez M.P., Romnero MA, Salas JM, Cardenas DJ, Molina J, Quiros M.. J. Mol. Struct. 344 (1995), 257-264. N(8)H N(7)H DMSO: 80% <20% Kryształ: 100% Wygląda na to, że główną formą 8-azaX jest forma N(8)H. Zatem czy to onafluoryzuje? Model:

  7. Fluorescencja N8-metylo-azaX: (▬▬), absorpcja w pH 3; (▬ ▬), absorpcja w pH 11; (○○○), wzbudzenie fluorescencji w pH 3; (∆∆∆),wzbudzenie fluorescencji w pH 11. (●●●), fluorescencja w 1 mM HCl; (×××), fluorescencja w pH 11; (++++), fluorescencja w metanolu. Wydajność fluorescencji (pH 9) - 60%(!!!)

  8. Fluorescencja 8-azaX (●--●) i N8-m-azaX (■■), mierzona w 420 nm, jako funkcja pH. Wartości pKa stanu podstawowego: 4.7(8-azaX) i ~7.2 (N8-m-azaX). ------------------------------------ Ale dlaczego fluorescencja N8-m-azaX poniżej i powyżej 7.2 jest identyczna?

  9. Kwasowość molekuł w stanach wzbudzonych może różnić się znacznie od kwasowości w stanie podstawowym: b-naftol: pKa = 9.3pK* ~ 2.8 fluorescencja formy anionowej występuje w pH > 2.5 (obok formy obojętnej!) ----------- ; cykl Foersterapozwala na obliczenie pK* na podstawie widm formy protonowanej i zdysocjowanej: - liczby falowe (w cm-1) przejść 0-0 dla obu form. Przesunięcie widm o 475 cm-1 w temperaturze 300 K oznacza pK* - pK = 1

  10. Jakie jest pK* dla N8-metylo-azaX (pKa ~7.4)? ≈ 29000 cm-1 ≈ 32900 cm-1 pK*-pK ~ - 8 (± 0.5) pK* ~ -0.5 (!!!!) Przykłady literaturowe:

  11. Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencjiN8-metylo-azaX w środowisku wodnym (420 nm) i metanolowym (340 nm)

  12. A jeśli tak, to… Wytłumaczenie pochodzenia fluorescencji 8-azaX w środowisku wodnym i metanolowym (fototautomeria anionu!) **Zagadka: jakie jest pK* dla 8-azaX?

  13. Dlaczego w środowisku wodnym nie pojawia się forma obojętna związku? dyfuzyjna stała przeniesienia protonu: V-1 = kdif 10-pH[A-]* kdif=5·1010 M-1·s-1 (dla przeniesienia protonu) k1 = k-1(pH=pK*) = V-1/[A-]*= 100.5·5·1010·s-1≈1.6·1011 s-1; czas przeniesienia protonu 6.3 ps. czas zaniku fluorescencji [AH]* (mierzony w metanolu): 0.85ns

  14. Czy rzeczywiście ten sam chromofor świeci w 8-azaX i N8-metylo-8azaX? Pomiary czasów zaniku fluorescencji (J. Sepioł, IChF PAN): • Wnioski: • ten sam chromofor w obu związkach i całym zakresie pH; • w pH < 3 obserwujemy tłumienie dynamiczne.

  15. Trochę wspomnień: Wierzchowski J.; Shugar, D. Luminescence studies on formycin, its aglycone, and their N-methyl derivatives: tautomerism, sites of protonation and phototautomerism. Photochem. Photobiol.1982, 35, 445-458. Wierzchowski, J.; Szczęśniak, M.; Shugar D. Fluorescence emission properties of the cation of 4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidine, an adenine analogue: evidence for phototautomerism. Z. Naturforsch.1980, 35c, 878-889.

  16. Inne przypadki fototautomerii wśród analogów purynowych: Taylor C.A., El-Bayoumi A.A., Kasha M., 1969, PNAS 63, 253-260.7-azaindol Wenska G.; Skalski B; Insinska M.; Paszyc S.; Verrall, R.E. Ground and excited state prototropic behavior of 1-(purin-6-yl)-3-methylimidazolium chloride. J. Photochem. Photobiol. A 1997, 108, 135-142. C. Santhosh and P. C. Mishra.Electronic spectra of 2-aminopurine and 2,6-diaminopurine: phototautomerism and fluorescence reabsorption. Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy, 1991, 47, 1685-1693. S. K. Srivastava and P. C. Mishra. Phototautomerism of the G---C base pair of DNA. Journal of Theoretical Biology, 93, 1981, 655-666.

  17. Zastosowanie w enzymologii: reakcja 8-azaX z fosforylazą ksanozynową (PNPII) z E. coli - (synteza 8-azaksantozyny -???) – B. Kierdaszuk. Puryna + rybozo-1-fosforan → nukleozyd + Pi Warunki: ~100 M 8-azaX, pH ~5, 2 mM rybozo-1-fosforan, 25 C.... Reakcja idzie.... tylko czy to aby na pewno produktem jest 8-azaksantozyna???

  18. ... i 9-benzylo-azaX Porównajmy.... Nukleozyd (??) pKa ~ 7.2; pKa ~ 5.7 Anion:absorpcja 305 nm, Anion: absorpcja 279 nm Emisja 440 nm Emisja 365 nm

  19. Co się dzieje? N7-nukleozyd? N8-nukleozyd? N9-nukleozyd? Chyba nie! A jak reaguje PNP ze ssaków? – Brak reakcji!!

  20. Dla porównania: Reakcja E. coli PNP-II z AzaGua: Porównanie widm produktu reakcji z widmami 8-azaguanozyny pokazuje, że w tym wypadku rybozylacja idzie na N-9 (z możliwą małą domieszką innych form). Dlaczego??

  21. Jakie mogą być z tego pożytki? • jeśli N8-metylo-azaGuanina jest substratem dla GDA….. to mielibyśmy czułą metodę analityczną dla tego enzymu • W kompleksach z białkami procesy ESPT będą przebiegały inaczej niż w wodzie – jak??? Na pewno można odróżnić ligand wolny od związanego…. • Aza-analogi kofeiny, teofiliny, teobrominy…… fluorescencyjne badania oddziaływań z receptorami? • ------ • PNPII – pierwszy enzym rybozylujący puryny (lub analogi) w pozycji innej niż N9?? • A w ogóle to dlaczego inne formy PNP rybozylują puryny na N9, jeśli N7-nukleozydy podlegają fosforolizie?

  22. REKLAMA Katedra Fizyki i Biofizyki UWM ogłosi wkrótce konkurs na stanowisko asystenta

More Related