El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias

1. El Laboratorio en la Evaluación de las Inmunodeficiencias Primarias Evaluación de la Inmunidad Celular Laboratorio de Inmunología Celular Servicio de Inmunología y Reumatología Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahn”

2. Mecanismos de defensa Barreras físicas Barreras químicas Mecanismos Innatos Mecanismos adquiridos Carecen de memoria inmunológica Generan memoria inmunológica Celulares: Macrófagos, Cel Dendríticas, linfocitos NK Factores solubles Complemento Citoquinas, Proteínas de fase aguda Celulares:Linfocitos T y B Moleculares:Anticuerpos

3. Células responsables de la inmunidad innata Células Dendríticas Interdigitadas Monocito/ Macrófago Células natural killer Neutrófilo • Fagocitosis. • -Activación de los linfocitos T Fagocitosis Eliminación de microorganismos: moléculas tóxicas intracelulares • Fagocitosis. • APC Citotóxicas.

4. Respuesta Inmune Específica Receptor B Receptor T Linfocito B Linfocito T

5. MHC Class I T citotóxicos T colaboradores TH1: IL2, IFN TH2: IL4, IL5 MHC Class II Respuesta Inmune Específica Bases del Reconocimiento T MHC Clase I

6. Respuesta T Ag Expansión Clonal T activadas Diferenciación T efectoras T Memoria

7. Inmunodeficiencias PrimariasRelación Deficiencia /Germen

8. Clasificación de las IDP* *International Union of Immunological Societies Primary Immunodeficiecy

9. Estudio de la Inmunidad Celular Evaluación cuantitativa y funcional de las distintas células del sistema inmune. Nivel I: screening sencillos. definir tipo y grado de ID y orientar a la conducta terapéutica Nivel II: complejos requieren especialización en su realización e interpretación muchos pueden definir el diagnóstico

10. Evaluación de la Inmunidad Celular Hemograma Recuento linfocitario Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo) Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro Estudios Complementarios Determinación de citoquinas ( IL2, IFN, IL4, IL12) Post cultivo con distintos estímulos (ELISA, Citometría de Flujo) Up-regulación de proteínas post estímulo CD40 L, CD25, ICOS , etc. Citometría de Flujo Estudio de señalización intracelular Fosforilación proteínas. WB, Citometría de Flujo

11. Citometría de Flujo: permite la medida simultánea de múltiples parámetrosde células en suspensión cuando estas encolumnadas en un flujo son incididas por un láser Células en suspensión Celda de Flujo Células pasan en fila Fluorescencia emitida de células marcadas LASER FSC SSC Punto de interacción

12. Datos obtenidos del Citómetro de Flujo Parámetros de dispersión de luz FSC (Forward scatter) : relacionado con el tamaño de la célula SSC (Side Scatter) : relacionado con la complejidad interna (granularidad) de la célula

13. Datos obtenidos del Citómetro de Flujo Parámetros de Fluorescencia Señales emitidas por fluorocromos (Anticuerpos conjugados , colorantes) Láser PercP PE FITC Total de parámetros por célula: 5 (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3)

14. Citómetro de Flujo SSC (granularidad) Señales detectadas por detectores convertidas en señal electrónica FL1 Láser FSC (tamaño) FL2 Procesadas por un software FL3

15. Análisis de datos: gráfico de puntos I II (+ ) verde (- ) rojo (+ ) verde (+) rojo IV III (- ) verde (-) rojo (- ) verde (+) rojo % de células que expresan un marcador “X” en cada uno de los cuadrantes

16. Análisis de leucocitos de Sangre Periférica SSC vs CD45 FSC vs SSC Leucocitos normales SP Leucocitos normales SP Eo Lin SSC PMN Mo Bas Lin CD45 FITC CD45: Antígeno Común Leucocitario

17. Incubación 15´ T°amb oscuridad Lavados Resuspender Técnica estándar de marcación con anticuerpos monoclonales Lisante Muestra Anticuerpos Monoclonales Adquisición

18. Panel de anticuerpos monoclonales para identificar sub poblaciones linfocitarias

19. Sub - poblaciones linfocitarias B:24% CD19 T:68% NK:6% CD56 T:68% T+ B+ NK  100% CD3

20. CD3 CD3 Sub - poblaciones T Seguimiento de pacientes coninfección por VIH CD4 CD8 37% 31% Gate de linfocitos CD3:70% %CD4 + %CD8  %T 39% DP CD8 56% DN CD4

21. HLA-DR CD95 CD 25 49% 94% 30% 78% 38% 92% CD45RO CD45RA CD62L Estudio fenotípico de linfocitos T Activación T:CD45RO, CD62L, CD95, CD25, CD44 Linfocitos T Naive: CD45 RA, CD31 Linfocitos T CD8/CD4 memoria / efectores:CD27, CD28, CCR7, CD45RA Características fenotípicas de linfocitos hiper- activados LinfocitosT Linfocitos T CD4+

22. Valores normales en pediatría Sub poblaciones linfocitarias

23. Valores normales en pediatría Antígenos de diferenciación/activación Grupo etario activación naive memoria

25. Etiologías de Inmunodeficiencia Combinada Severa Proteína Fenotipo Cadena Rc IL7 Cadena  CD3 Cadena  CD3 T- B + NK+ Cadena c Rc IL2 Jak 3 CD45 T- B + NK- RAG1/ RAG2 Artemis Ligasa IV T- B- NK+ T- B - NK - ADA

26. Familia de receptores de la cadena común T- B+ NK-

27. Paciente con deficiencia en la cadena  c IDCS : T- B+ NK- Linf T: 0% NK: 0% Linf B: 98% Proliferaciones linfocitarias PHA: no prolifera PHA +IL2: no prolifera

28. AR X recesiva Diferenciación B:defectos genéticos que la bloquean

29. CD19 8% 32% 0% HLA-DR CD16&56 90% 91% CD3 56% CD8 Fenotipo de paciente con A-gammaglobulinemia de Bruton Mutaciones en Btk 38% CD4

30. Evaluación de la Inmunidad Celular Hemograma Recuento linfocitario Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo) Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro Estudios Complementarios Determinación de citoquinas ( IL2, IFN, IL4, IL12) Post cultivo con distintos estímulos (ELISA, Citometría de Flujo) Up-regulación de proteínas post estímulo CD40 L, CD25, ICOS , etc. Citometría de Flujo Estudio de señalización intracelular Fosforilación proteínas. WB, Citometría de Flujo

31. Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro Cultivo de Linfocitos Mitógenos:estimulantes policlonales PHA linfocitos T Con A PWM linfocito T y B PMA/Io 72 hs LPS linfocito B Anticuerpos: Anti-CD3, Anti-CD2: linfocitos T Anti- cadena : linfocitos B Super Antígenos: 1/5 – 1/50 SEB, SEA Células Alogeneicas:Cultivo Mixto Linfocitario 1/500 6 días Antígenos: 1/10000 – 1/100000 Toxoide Tetánico PPD Candidina

32. Activación in vitro del linfocitos T Anti CD3 Entrecruzamiento de distintos ligandos de superficie por su unión a carbohidratos PHA SEB /SEA Antígenos Anti- CD28 Ionomicina Acción intracelular PMA FOS IL2 exógena JUN

33. Estudio de la proliferación de linfocitos por incorporación de Timidina Tritiada Obtener CMT a partir de SP por gradiente de Ficoll Hypaque CMT lavar y ajustar concentración 2 x 106 cel /ml Muestra Ficoll- Hypaque CMT + Mitógenos/ Antígenos 5 horas finales del cultivo incubar 72 hs mitógenos ( 6 días Antígenos) a 37ªC en 5% CO2 Cosechar TIMIDINA 3H Leer en contador β Cuentas emitidas /min (cpm) Paciente Control normal

34. Proliferaciones linfocitarias in vitro Expresión de resultados Proliferación a Mitógenos alteradas Proliferación a Antígenos ausente

35. Evaluación de la Inmunidad Celular Hemograma Recuento linfocitario Evaluación de sub-poblaciones linfocitarias (Citometría de Flujo) Evaluación de la respuesta proliferativa in vitro Estudios Complementarios Determinación de citoquinas ( IL2, IFN, IL4, IL12) Post cultivo con distintos estímulos (ELISA, Citometría de Flujo) Up-regulación de proteínas post estímulo CD40 L, CD25, ICOS , etc. Citometría de Flujo Estudio de señalización intracelular Fosforilación proteínas. WB, Citometría de Flujo

36. Endocrinológico: Resistencia a GH. Sindrome tipo Laron Caso clínico: paciente femenina de 16 años Inmunológico: Eczema generalizado Infecciones respiratorias bajas severas recurrentes / enfermedad pulmonar crónica Diarrea crónica recurrente Varicela prolongada / Queratitis por herpes zoster Sospecha diagnóstica: deficiencia de Stat 5b

37. GH IL -2 Jak2 Jak2 Jak1 Jak3 Stat5 a/b Stat5 a/b Stat5 a/b Stat5 a/b Vía de señalización de GH e IL2   P  P P Stat5 a/b P EXPRESIÓN GÉNICA ISRE/GAS RESPUESTA BIOLÓGICA

38. Fosforilación de Stat 5 a/b mediada por IL2 Normal Paciente 51% 71% MCFI: 206 MCFI: 434 M1 M1 Fosfo-Stat5

39. Expresión de proteínas Stat 5 a/b Paciente Normal MCFI: 443 MCFI: 291 M1 M1 Stat5 Normal Paciente STAT5b ausencia Western Blott con anti-Stat5b Actina

40. Células responsables de la inmunidad innata Células Dendríticas Interdigital Monocito/ Macrófago Células natural killer Neutrófilo • Fagocitosis. • Activación de los linfocitos T Fagocitosis Eliminación de microorganismos: moléculas tóxicas intracelulares • Fagocitosis. • APC Citotóxicas. 8-10% de linfocitos

41. Estudio de las células Natural Killer (NK) en IDP Cuantificación: citometría de flujo (CD3-CD56+) Funcionalidad: actividad Citotóxica Estudio de proteinas citoplasmáticas: perforina, granzimas Estudio de la degranulación por Citometría de flujo Búsqueda de mutaciones

42. Sistema de Reconocimiento de la Célula NK Receptores inhibitorios (Killer- inhibitory Rc: KIR) Receptores activadores (Killer activating Rc) Propio Célula normal Célula NK Pérdida de lo propio Perforina granzimas Célula anormal (maligna /virus) No propio Célula alogeneica

43. Medida de la Actividad Citotóxica de Células NK Ensayo de liberación de Cr51 Célula Target: K562(línea derivada de leucemia mieloide crónica en crisis blástica) Células Efectoras: Células Mononucleares Totales (CMT) a) + Cr51 Incubar 1 hora a 37°C K562 b) Se enfrentan cantidades constantes de K562 con cantidades variables de CMT Liberación espontánea Liberación total Rel CMT: K562 medio tritón 50:1 25:1 12.5:1 K562 K562 K562 K562 K562 K562 Incubar 4 horas a 37°C Cpm exp-cpm espontánea Cpm máx- cpm espontánea x100 Leer sobrenadante en contador 

44. Linfohistiocitosis Hemofagocítica Fiebre-hepato-esplenomegalia-pancitopenia- hemofagocitosis

45. Linfo-histiocitosis hemofagocítica familiar Perforina Deficiencia Munc 13-4 Sintaxina 11 STXBP2

46. De-granulación en linfocitos T citotóxicos Eventos de señalización : Perforina

47. Paciente con Clínica de Síndrome Hemofagocítico Cpm experimento - cpm espontánea Cpm máxima - cpm espontánea x100 Células NK:5% (en total de CMT) Actividad NK ausente Búsqueda expresión de perforina. (CF) defectos de degranulación (CF) defecto molecular (Biol. Mol.)

48. Células responsables de la inmunidad innata Células Dendríticas Interdigital Monocito/ Macrófago Células natural killer Neutrófilo Fagocitosis Eliminación de microorganismos: moléculas tóxicas intracelulares • Fagocitosis. • Activación de los linfocitos T • Fagocitosis. • APC Citotóxicas. Mecanismos de defensa bacterias intracelulares dependiente de IFN gamma Mecanismos independiente del O2 Mecanismos dependiente del O2

49. Estudio de la respuesta inmune innata Fagocitos Nivel I: Estudio cuantitativo: - Granulocitos y monocitos/mm3. - Moléculas de adhesión : CD11, CD15, CD18. Estudio funcional: Mecanismos microbicidas O2 dependientes: NBT, DHR, Quimioluminiscencia. Nivel II: Estudio funcional: - movilidad de fagocitos (leucotaxis) - actividad bactericida. - evaluación de la vía de transducción de señales del IFN-  e IL-12. Estudio cuantitativo-funcional: Actividad enzimática de MPO, G6PD. Estudio molecular: búsqueda de mutaciones en genes asociados con IDP de fagocitos (je.: CYBB, CYBA, p47phox, p67phox, elastasa, etc.)

50. Expresión de moléculas de adhesión en neutrófilos CD18 / CD11a Deficiencia de integrina β2 CD18 / CD11b CD18 / CD11c Deficiencia de moléculas CD15 fucosiladas (Sialil- Lewis X) Deficiencia de moléculas de Adhesión LAD 1 LAD 2 Gate en neutrófilos