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实验五 1. 酶联免疫吸附试验( ELISA) 2. 补体结合反应. 1. 酶联免疫吸附试验( ELISA). 免疫标记技术. 定义: 将抗原 - 抗体反应与标记技术相结合,用 放射性同位素、酶或荧光素 标记的已知抗体或抗原,通过检测标记物,间接测定未知的抗原或抗体。 分类: 放射免疫测定法: 131 I , 32 P 免疫荧光技术: FITC , PE 免疫酶测定法: HRP , AP. 免疫酶测定法 ( E nzyme I mmuno A ssay,EIA). 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶 (HRP) ,碱性磷酸酶 (AP)
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实验五 1.酶联免疫吸附试验(ELISA)2.补体结合反应
免疫标记技术 • 定义: 将抗原-抗体反应与标记技术相结合,用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原,通过检测标记物,间接测定未知的抗原或抗体。 • 分类: • 放射免疫测定法:131I,32P • 免疫荧光技术:FITC,PE • 免疫酶测定法:HRP,AP
免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) • 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 • 辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP) • 特点: • 高度特异性:保持抗原抗体反应的特异性 • 高灵敏度:酶催化底物显色的高效性,pg水平微量检测 • 定性定量检测:反应液颜色深浅或光密度值 • 分类: • 酶联免疫吸附试验:可溶性抗原或抗体 • 酶免疫组化法: 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 1.定义 用酶标记抗原或抗体检测液体(血液、细胞液)中未知抗体或抗原的方法。 • 间接法(Indirect ELISA): • 将已知抗原吸附于固相载体,酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体 • 双抗体夹心法(Sandwich ELISA): • 将已知抗体吸附于固相载体,酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原 • 竞争法(Competitive ELISA) : • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体,酶标记抗原或抗体 • 检测液相中的可溶性抗原或抗体 2.分类
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 3. 原理(以间接性ELISA为例): 显色
实验材料 • 脱纤维绵羊红细胞——抗原 • 兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素)——待测兔血清 • HRP标记羊抗兔IgG ——二抗 • 包被缓冲液:0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 • 洗涤液:含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS • 底物缓冲液: pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 • 底物溶液:OPD 10mg,底物缓冲液25ml,30% H2O2 40μL • 酶标板,酶标仪
实验方法 脱纤维绵羊血 加3mL N.S,混匀 2000rpm,5min 1.抗原的处理: 加3mL N.S,混匀 2000rpm,5min 取2mL压积红细胞 加入2mL蒸馏水,震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成1:400备用 取酶标板,加入100μL/孔的抗原稀释液 2.包被抗原: 4℃,湿盒内,18h
取出包被好抗原的酶标板(4孔/组),甩干孔内液体取出包被好抗原的酶标板(4孔/组),甩干孔内液体 实验方法 以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次 1 2 3 4 3.加待测血清 标记各孔,加入相应液体100μL/孔 空白 阴性 阳性 待测 37℃,湿盒内,30min 甩干孔内液体 4.加二抗: 以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次 各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃,湿盒内,30min 甩干孔内液体 5.显色: 以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次 加入底物溶液100μL/孔 6.观察结果 避光显色,10min
预期结果 • 阳性:显色为黄色 • 阴性:无色 1 2 3 4 阴性 阴性 阳性 阳性
注意事项 • 洗涤彻底,避免交叉污染。 • 按顺序加样,孔底无气泡。 • 包被和温育在湿盒内进行。
补体结合反应: 是指在补体的参与下,以绵羊红细胞(SRBC)和溶血素(抗SRBC的抗体)作为指示系统的抗原抗体反应。 概念:
原理: 补反中包括两个系统五种成分: • 待检系统:已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 • 指示系统:绵羊红细胞和溶血素。
1 2 1:No Ab;2:Ab 待测系统 抗原+未知血清 指示系统 SRBC+抗SRBC抗体 补体 1 2 1 2 Step 1 抗原抗体复合物的形成 Step 2 补体的结合和耗竭 Step 3 SRBC的裂解
待测血清 Y Y Y Y Y Y Y Y Ab 阳性 No Ab 阴性 Ag Ag Ag Ag Y
材料: • 抗原:伤寒菌裂解产物 • 待测血清:56℃,30min • 补体:豚鼠血清 • 2%绵羊红细胞 • 溶血素
血清 对照管 抗原 对照管 补体 对照管 SRBC 对照管 试验管 方法: 1 2 3 4 5 (1份/2人) … … … … … … 0.2mL 0.2mL 待测血清 抗原 … … … … … … 0.2mL 0.2mL 补体 … … 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL N.S … … 0.2mL 0.4mL 0.8mL 0.2mL 摇匀,37℃,水浴15min … … 溶血素 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL SRBC 0.2mL 0.2mL 0.2mL 摇匀,37℃,水浴15min
预期结果: 1.管内液体混浊呈浅红色为不溶血,管内液体透明呈红色为溶血。 溶血 不溶血 2.
注意事项: • 绵羊红细胞用前应轻晃混匀,不可剧烈震荡。 • 各种试剂的吸管不可混用。