DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA

1. DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA FERTILIDADE Estradiol Ultrasensível Progesterona HCG Estradiol TIREÓIDE TSH Anti-receptor TSH T3 e T4 livres TBG Calcitonina TSH neonatal ENDOCRINOLOGIA ACTH Aldosterona Renina MARCADORES TUMORAIS PSA total PSA livre DIABETES Insulina Peptídio C TOXICOLOGIA ALÉRGENOS AC DE ALERGIAS FARMACOLOGIA DOENÇAS VIRAIS E BACTERIANAS

2. Radioimunoensaio (RIA ou RIE) • Vantagens • Sensível, rápido e preciso • Análise quantitativa de reação Ag-AC • Limiar detecção: nanogramas (10-9 g) e picogramas (10-12g) • Limitações • Alto Custo • Vida média dos reagentes (radioisótopos) • Risco operacional • Radioisótopos mais usados • 125I - vida média de 57,5 dias e 131I – vida média de 8 dias • Etapas do teste • Cuva de calibração: diluições de substâncias com concentrações conhecidas • (padrões/calibradores) • Ensaio • Contagem da radiação:  ou  (contador de cintilação) ouγ (contador de radiação gama) • Controle de qualidade • Tipos de RIE • RIE direto de competição com Ag marcado • RIE direto de competição com AC marcado • Ensaio Imunorradiométrico (IRMA)

3. Radioimunoensaio • Princípio: • Ac que reconhece especificamente o analisado Precipitado com baixas contagens Soro tem muito analisado circulante AC AC AC AC AC = + Soro com quantidade desconhecida de analisado e Soro com analisado marcado I125 Precipitado com altas contagens Soro tem pouco analisado circulante

4. RIE direto de competição com Ag marcado • AC ligado ao suporte sólido • Adição do Ag marcado + amostra ou padrão • Lavagem para remoção Ag não ligado • Medida da radiação • Resultados: • Ag na amostra ou padrão =  radiação  Ag na amostra ou padrão=  radiação RIE direto de competição com AC marcado • AG ligado ao suporte sólido • Adição do AC marcado + amostra ou padrão (Ag) • Lavagem para remoção AC não ligado ao • Ag fixado ao suporte sólido. • Medida da radiação • Resultados: • Ag na amostra ou padrão =  radiação  Ag na amostra ou padrão=  radiação

5. Ensaio Imunorradiométrico (IRMA) • Quantidade fixa Ac no fixada no suporte • Adição da amostra (quantidade Ag desconhecida) ou padrão (quantidade Ag conhecida) • Incubação • Lavagem e remoção dos Ag não ligados • Adição do 2º AC (marcado) • Lavagem e remoção dos 2º AC não ligados • Medida da radiação • Resultados: •  Ag na amostra ou padrão =  radiação

6. Enzimaimunoensaio • Quantitativo = reação AG-AC monitorado através de atividade enzimática • Vantagens: • Alta sensibilidade • Reagentes estáveis e seguros • Rapidez • Exigências para a enzima ser usada no teste: • Alta atividade específica • Produto formado estável • Fácil quantificação • Ser estável, de preço acessível e de fácil obtenção • Ex: peroxidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, -galactosidase, anidrase carbônica, • acetilcolinesterase, glucoamilase, lisozima, malato desidrogenase, glicose-6-P-desidrogenase, • ribonuclease • Métodos: • ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima) • EMIT (Imunoensaio enzima multiplicado) • Imunoblotting

7. ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima • Objetivo: • Quantificar um antígeno pelo uso de um AC específico ligado à enzima

8. ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima • Imobilização do AC ou AG em um meio sólido (agarose, poliacrilamida, placas poliestireno,etc) • Bloqueio dos sítios reativos da placa com proteína (leite desnatado, soroalbumina bovina, • gelatina, caseína, etc). • 3. Diluição da amostra • 4. Lavagens entre os períodos de incubação • 5. Para revelação da reação usar substrato cromogênico da reação enzimática • (ex. H2O2, ortotoluidina, ABTS e TMB).