Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140

1. Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140 Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů

2. Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin R CH COOH R CH COO- NH2 NH3+ Aminokyseliny - amfionty Komerční - většinou hydrochloridy (NH3+Cl-) Amfolyty- sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady

3. pH 4 - 8 → aminokyselin jako amfionty Proteiny – amfolyty - na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězců AK schopných disociace

4. R CH COO- NH3+ 1 pI = (pK1+ pK2) 2 pI amfolyty přijímají H+ amfolyty odštěpují H+ NH3+RCOOH NH2RCOO- Isoelektrický bod (pI) Isoelektrický bod - Hodnota pH, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule pI proteinů: neutrální cca 5-6 kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11

5. Purifikace proteinů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství enzymu) Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátu počet purifikačních kroků – omezení ztrát, časová a finanční náročnost Žádná metoda není dokonalá – je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužit Typ purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky. - záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)

6. Metody • základní • rozpuštění • hrubé oddělení • speciální • izolace • stanovení převedení biomolekul do kapalné fáze homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové, ... Metody obecně používané v biochemických laboratořích

7. Volba separační metody Dělení látek podle rozdílných vlastností: molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita Metoda pokusu a omylu obvykle nedává optimální výsledky Metody používané v programu: purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace) kontrola stupně purifikace – celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení

8. protein (NH4)2SO4 zvýšení rozpustnosti (NH4)2SO4 snížení rozpustnosti Srážení (NH4)2SO4 - vysolování různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích vsolování – snižování hydrofobních int. vysolování – ztráta hydratačního obalu Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)

9. Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.

10. Dialýza Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace → nižší koncentrace Použití: odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru) koncentrační gradient Membrány, dutá vlákna Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da → 1 000 kDa voda, pufr s nízkou iontovou silou elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli odsolování – MWCO 10 (25) kDa

11. Ionexová chromatografie Chromatografie na měničích iontů Ion Exchange Chromapography - IEC Princip: separace podle náboje Iontoměniče (ionexy - “ion exchangers”) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázané ionizovatelné skupiny. porézní materiály elektrostatické interakce –eluce změnou pH, iont. síly

12. Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj katex - výměna kationtů anex - výměna aniontů Na+, H+ Cl-, OH- Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly Pevnost vazby - pH, iontová síla roztoku

13. P- P+ Vliv pH na velikost náboje: pH: většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5 - 6 a je stabilní obvykle v rozmezí pH 6 - 9 katex: pH 3 – 8(bazické proteiny) anex: pH 5 – 10 většinou vazba na anex Vliv iontové síly: vyšší iontová síla → slabší vazba na ionex

14. Silné ionexy – jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH(sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny) Slabé ionexy – jejich ionizovatelnost je silně závislá na pH. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při pH 6 - 9, jinak ztrácejí náboj Funkční skupiny CM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katex S sulfomethyl- silný katex SHP sulfohydroxypropyl- silný katex DEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anex QAE kvarterní aminoethyl- silný anex Q kvarterní amin – silný anex TMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex

15. Průtoková rychlost: závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částic rychlost 3 - 10 ml.cm-2.min-1 (cca 5 cm/h) Eluce: vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směr gradient pH – směrem k pI příkrost gradientu (příkrý - menší naředění,nižší rozlišení) celkový objem eluentu – 10ti – 20ti násobek objemu náplně kolony

16. Chromatografie s hydrofobní interakcí Hydrofobní interakce Makromolekuly - hydrofobní skupiny (na povrchu nebo zanořené v kapsách) Zcela hydrofobní materiály (polystyren) – vazba molekuly ireversibilní (denaturace) hydrofobní sorbenty – hydrofobní zóny ligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-

17. Síla vazby roste s: rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH4)2SO4, teplotou, nejsilnější interakce: pH – pI Síla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.

18. Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu relat. nezávislá na složení mobilní fáze Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys. malé molekuly – difuse do struktury gelu → pomalejší postup kolonou velké molekuly – volně protékají nesferické molekuly - chovají se jako by byly větší

19. vzdálenost mezi separovanými zónami Rs = šířka zón Stupeň rozlišení: Rs> 1.2 Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). → opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon Aplikace vzorku: objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30% neúčinné dělení zředěných vzorků!!!

20. Frakcionační rozsah gelu: Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu. Sephadex G-25 1 – 5 kDa Sephadex G-100 4 – 150 kDa mez vyloučení- velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórů gelu molekuly penetrují do gelu bez zábran Ve → Vt molekuly nepronikají do gelu Ve → V0

21. Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovací mezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.

22. Použití: orientační stanovení Mr, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kDa) purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25) Výhody: šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky – ale nesmí být moc viskozní), teplotě levná, jednoduchá Omezení: nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) – omezení vlivu difuse

23. techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou

24. Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.

25. precipitace dialýza, gelová f. G-25 hydrofobní interakce ionexová chromatogr. (afinitní chromatogr.) (elektroforesa) zakoncentrování vzorku odstranění částečně zdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů gelová filtrace obsah solí, pH – není důležité objem a koncentrace vzorku

26. Obsah protokolu: 1. Číslo a charakteristika enzymu 2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité metody a nastavení jejích parametrů 3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek – případné ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace 4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky 5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu