Université  Dr. Moulay Tahar de SAIDA
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 50

Biochimie appliquée PowerPoint PPT Presentation


  • 364 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA. Biochimie appliquée. II- Biochimie des substances d’origine animale (2) . Préparé par: Mr. HALLA Noureddine. Culture de cellules animales (eucaryotes): Le cycle cellulaire et les moyens d'études.

Download Presentation

Biochimie appliquée

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Biochimie appliqu e

Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA

Biochimie appliquée

II- Biochimie des substances d’origine animale (2)

Préparé par:

Mr. HALLA Noureddine


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales (eucaryotes):

  • Le cycle cellulaire et les moyens d'études


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Culture de cellules animales

leur placement ultérieur dans un environnement artificiel

récipients de cultures appropriés contenant un milieu liquide ou semisolide

le prélèvement de cellules, tissus ou organes d'un animal ou d'une plante

qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à la croissance.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Différentes sources

  • Insectes

Poissons

  • Mammifères

Humains


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Différents types

  • Épithéliales/endothéliales (membranes)

  • Fibroblastes

  • (tissus connectifs)

  • Myoblastes (muscles)

  • Neurones (syst. nerveux)

  • Hépatocytes (foie)

  • Erythrocytes (sang)

  • Lymphocytes

  • (syst. immunitaire)


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Différents types

  • Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).

  • Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions).

  • Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Différents types


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Evolution des cellules en culture

Courbe de croissance d'une population cellulaire

A partir du premier repiquage on parle de lignée cellulaire

les cellules viables se fixent sur le support alors que les mortes restent dans le milieu de culture


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Evolution des cellules en culture

Longévité d'une culture cellulaire

  • On rencontre 2 cas :

1

2

  • - Cultures normales ou définies : les cellules ne se multiplient que pendant un nombre limité de générations (30 à 50 repiquages) puis meurent : leur vie et leur mort est programmée.

  • On observe alors une diminution de leur vitesse de prolifération, phase de sénescence.

  • - Culture continue ou lignées transformées ou immortelles. La vitesse de multiplication ne diminue pas, ce qui permet un nombre de repiquage indéfini. Ces cellules adhérentes perdent leur besoin d'ancrage et peuvent être cultivées en suspension.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Cellules transformées

Naturelles

  • Virales

  • Chimiques

immortalisées spontanément in vitro

- mutées pour des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (comme par exemple la protéine p53).

transformées artificiellement par un virus oncogène (c.à.d. un gène immortalisant tel que T de SV40)


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

  • Différentes lignées

MRC5, W138

HeLa

CHO

Vero

Sf9

293

reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile

secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins

Spodopterafrugiperda, stable, système d’expression baculovirus

cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche

ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile

embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S)


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Caractéristiques générales

Capable d’exocytose

Ne sécrète pas d’enzymes

Modifications post-traductionnelles

Introns/épissage (splicing)


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

pour étudier :

Systèmes de modèles

La biologie et la biochimie cellulaires de base,

1

les interactions entre les cellules et les agents induisant des maladies,

2

les effets des médicaments sur les cellules,

3

Le processus et le déclenchement du vieillissement

4

5

les études nutritionnelles.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

pour étudier les effets de nouveaux médicaments, cosmétiques et produits chimiques sur la survie et la croissance d'une grande variété de types de cellules.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

Les cellules normales et les cellules cancéreuses pouvant toutes deux être cultivées.

De plus, il est possible, en utilisant des produits chimiques, virus et rayonnements, de convertir les cellules cultivées normales en cellules cancéreuses.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

  • la réplication de virus dans les cultures cellulaires (à la place des animaux) pour les utiliser dans la production de vaccins.

Recherche sur le cancer

Virologie

  • en détection clinique et isolement de virus,

  • en recherche fondamentale pour étudier comment ils se développent et infectent les organismes.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

trois domaines se sont montrés plus intéressants:

Systèmes de modèles

la production à grande échelle de virus pour une utilisation en production de vaccins.

Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

la production à grande échelle de cellules génétiquement modifiées pour produire des protéines présentant une valeur médicale ou commerciale. (les anticorps monoclonaux, l'insuline, les hormones, etc.)

Virologie

La cellule comme usine de production

l'utilisation de cellules en remplacement de tissus et d'organes.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

Virologie

La cellule comme usine de production

un outil important pour le diagnostic précoce d'affections embryonnaires

Conseil génétique


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

Virologie

La cellule comme usine de production

La capacité de reprogrammer les cellules en culture par du nouveau matériel génétique (ADN et gènes) pour étudier les effets cellulaires de l'expression de ces gènes (nouvelles protéines).

Conseil génétique

Génie génétique


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

Virologie

La cellule comme usine de production

Conseil génétique

Génie génétique

Les cellules sont cultivées un moment puis réimplantées dans le patient.

Thérapie génique


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles

Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

Virologie

La cellule comme usine de production

Conseil génétique

Génie génétique

Thérapie génique

Découverte de médicaments


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Définition

Définition

Le cycle cellulaire est l'ensemble des phases par lesquelles une cellule passe entre deux divisions successives.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Généralités

  • La division cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Généralités

Les phases du cycle de division cellulaire

la mitose

Interphase


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Généralités

Les phases du cycle de division cellulaire


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Généralités

Les kinases cycline-dépendantes

Entre 1990 et 2000, une douzaine de Cycline / Cdk sont décrites chez l’homme.

Six d’entre elles interviennent dans le contrôle direct du déroulement du cycle cellulaire.

Les Cdk sont des sérine-thréonine kinases


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Généralités

Les kinases cycline-dépendantes


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

Les facteurs mitogènes

G1

G1

tyrosine kinases ou encore couplés à des protéines G.

S

S

G2

G2

P

P

M

M

cascades

P

la stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l’entrée en division (en particulier cyclines D, CDKs).


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

Plusieurs facteurs

G1

G1

Les cellules sont maintenues en G1

S

S

La famille E2F

Protéines de la famille du rétinoblastome, pRb, p107 et p130

G2

G2

M

M

Transcription


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

Cycline E/ Cdk 2

Cycline D / Cdk 4

Cycline D / Cdk 6

P

G1

G1

Progression G1

P

S

S

La famille E2F

Protéines de la famille du rétinoblastome, pRb, p107 et p130

G2

G2

M

M

Transcription de l’ADN


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

La fin de G1 – préparation à la transition G1/S

La famille E2F

G1

ORC

(Origin Recognition Complex )

assemblage d’un complexe préréplicatif (pre-RC)

G1

S

S

G2

G2

accrochage

M

M

recrute

cdc6

  • cdt1

complexe MCM 2-7

(mini-chromosome maintenance )

facteur de transcription

ATPase


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

La transition G1/S

Plusieurs protéines et complexes protéiques doivent s’associer aux complexes pré-réplicatifs afin que la synthèse d’ADN puisse commencer

G1

G1

Activation

S

S

DNA topoisomerases

ORC

G2

G2

cdc7

MCM10

DNA polymerase

M

M

MCM

2-7

cdc45

Cycline E/ Cdk 2

DNA helicase


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

G1

G1

S

S

S

G2

G2

M

M


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

La phase G2 est souvent présentée comme une phase « de préparation » à la mitose. Elle est marquée par le début de la condensation des chromosomes.

G1

La kinase CDK1/cycline A est active en G2, mais ses fonctions demeurent inconnues. Sa participation à l’activation de est une hypothèse.

S

S

S

G2

G2

G2

M

M


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

CDK1/ cycline B (forme active)

G1

Condensine

S

S

G2

G2

G2

Survivine

Peroxiredoxine

M

M

Lamines

Nucleoline


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

  • La phase M comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l’enveloppe nucléaire, phases décrites il y a plus de cent ans :

correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l’enveloppe nucléaire

1

la prophase

G1

S

S

est la période de formation du fuseau et du début d’alignement des chromosomes

2

La prométaphase

G2

G2

G2

  • est la phase d’alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles

3

la métaphase

M

M

M

4

l’anaphase

voit la disjonction des chromosomes

est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la cytokinèse.

5

la télophase


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

La condensation des chromosomes

La condensation des chromosomes est parmi les premiers évènements morphologiques de la division qui aient été décrits

La condensine, un complexe constitué de 5 sous unités, est le principal responsable du phénomène de condensation chromosomique. Ses sous-unités sont, chez l’homme, hCAP-C, hCAP-E, hCAP-D2, hCAP-G et hCAP-H.

G1

S

S

La condensine conduit une seule réaction : le super-enroulement, ATP-dépendant, de la molécule d’ADN dans des conditions topologiques définies.

G2

G2

M

M

M

Enfin la phosphorylation de l’histone H3 (et de CENP-A) par la kinase Aurora-B est également directement impliquée dans la condensation chromosomique.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

Le fuseau mitotique

Les microtubules sont des assemblages non covalents d’hétérodimères de tubuline α et β

G1

S

S

G2

G2

M

M

M


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

La séparation des chromatides et la transition métaphase/anaphase

G1

S

S

G2

G2

M

M

M


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

La cytokinèse

La cytokinèse est l’étape finale de la division qui conduit à l’individualisation des deux cellules-filles

G1

S

S

G2

G2

M

M

M


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités

Le cycle des centrosomes

G1

S

S

G2

G2

M

M

M


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Observation directe: cellules en phase M

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Observation directe: cellules en phase M

La durée moyenne est déduite selon le calcul suivant : le temps en culture x [log2]/[log facteur de multiplication du de nombre de cellules]

Une observation générale

Etudes de cellules vivantes avec le Microscope à contraste de phase.

Vidéomicroscopie de time lapse


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

1

la thymidinetritiée (3H-thymidine)

2

un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI (À l'aide de la technique de cytometrie de flux )

3

Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur ADN.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

1

la thymidinetritiée (3H-thymidine)

pour mesurer l'activité de l'ADN polymérase, (une façon indirecte pour mesurer la division cellulaire)


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

1

la thymidinetritiée (3H-thymidine)

autoradiographies


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

2

un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI (À l'aide de la technique de cytometrie de flux )

Pour estimer l’état prolifératif d’une population cellulaire par une estimation du pourcentage de cellules en phase S (estimation du contenu en ADN par cellule.


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

3

Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur ADN.

Pour estimer le pourcentage des cellules en phase S de façon plus précise


Biochimie appliqu e

  • Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)

Détermination de l’activité des protéines kinases cycline-dependantes (Cdk)

Les protéines impliquées dans la commande du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux études chez la levure (Saccharomyces Cerevisiae et Schizosaccharomyces ).


  • Login