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A Trial on Hydrodynamic-Based Transfection

A Trial on Hydrodynamic-Based Transfection. 生物科学 0701 王少华 张峰. Introduction. 流体力学转染：利用短时间内的大量液体注射帮助裸 DNA 进入生活细胞. 原理假说： Andrianaivo 等认为通过“流体力学转染”的外源基因表达是由小量快速进入胞浆的 DNA 分子引起的，并认为这是注射后压力升高引起质膜孔洞变化造成 Kobayashi 等的实验验证了这种猜想，他们发现流体力学注射可暂时性增加细胞膜的通透性，基因转染率取决于尾静脉注射的大容量和高速度两方面的转染因素

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A Trial on Hydrodynamic-Based Transfection

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Presentation Transcript

  1. A Trial on Hydrodynamic-Based Transfection 生物科学0701 王少华 张峰

  2. Introduction 流体力学转染：利用短时间内的大量液体注射帮助裸DNA进入生活细胞 原理假说： Andrianaivo等认为通过“流体力学转染”的外源基因表达是由小量快速进入胞浆的DNA分子引起的，并认为这是注射后压力升高引起质膜孔洞变化造成 Kobayashi等的实验验证了这种猜想，他们发现流体力学注射可暂时性增加细胞膜的通透性，基因转染率取决于尾静脉注射的大容量和高速度两方面的转染因素 Zhang等的实验显示，流体力学注射可诱导暂时性静脉压力剧升，肝窗扩大和肝细胞膜通透性增加，这些物理性状的产生使生物大分子如质粒容易进入细胞内。

  3. AIM 探索“基于流体动力学的活体转染”的方法的可行性 探索小鼠活体组织细胞的提取和分析方法 学习组织荧光蛋白的检测方法 DESIGN

  4. MATERIAL

  5. PROTOCOL & RESULTS 注射

  6. PROTOCOL & RESULTS 组织细胞分离 8小时之后，分别对三只小鼠进行眼球取血，将动脉血作为血液对照。取血液细胞进行计数和检验。另分别取肝脏和脾脏采用如下方法进行细胞分离和表达检测。 • 直接分离肝脏细胞 • 将肝脏取下放入PBS中清洗，除去外表的结缔组织 • 将肝脏置于一个干净的培养皿中，加入少许PBS，将组织剪碎 • 加入0.25%胰酶消化5min • 3. 将液体和组织块用200目筛网过滤，在筛网上用注射器的活塞轻轻碾压，将组织块分离，并用PBS冲洗 • 4. 将滤液装入10ml离心管中，1000r/min离心5min,弃去上清 • 加入5ml红细胞裂解液，将沉淀细胞重悬，吹打均匀后静置5min，1000r/min离心5min，弃上清，用2mlPBS重悬，取一部分细胞进行计数 • 取少量细胞进行任氏染液染色，观察肝脏细胞的形态和数量 其余在荧光下观察

  7. 肝细胞任氏染液染色

  8. PROTOCOL & RESULTS • 冷冻切片 • 将新鲜的肝脏用PBS洗干净，用吸水纸吸取表面液体，用锡箔纸包好 • 将三块肝组织分别浸入液氮罐中，冷冻处理5min，取出备用 • 开启冷冻切片机，设定工作温度为-20℃，安装刀架及刀片。待工具准备好后，用胶水将样品固定在样品架上。 • 按照12um的间隔进行切片，将切下来的肝片贴在事先准备好的玻片上，在玻片背面按压利用手的温度将其融化使其粘在玻片上。放入烘箱干燥

  9. A B O B3 B B O

  10. PROTOCOL & RESULTS • 冷冻切片的免疫组化 • 为了能够更进一步检验GFP表达，设计采用免疫组化的方法进行GFP的标记。计划对三个实验组的冷冻切片样本分别用1:50和1:100的GFP抗体进行标记，每个滴度一片，共六片 • 将烘干的冷冻切片在TBS中洗10min • 将玻片平铺在托盘中，每片滴加0.5ml 30%H2O2，静置30min，用TBS清洗玻片，共三次，每次10min • 用1%BSA 滴加在切片上37℃孵育1h3.TBS清洗3遍，每次10min • 分别在三组样本的六片玻片上滴加1:50和1:100的GFP抗体（用1%BSA稀释），37℃孵育2h。TBS清洗3次， 每次10min • 分别在六片样本上滴加1:20000稀释的带有HRP的兔抗鼠二抗，37℃孵育1h。TBS清洗3次，每次10min • 滴加0.5mg/mlDAB反应液，每毫升DAB溶液中加入4ul3%双氧水，置于37℃反应15min • 浸入TBS终止反应，清洗晾干后镜检

  11. A B A B

  12. DISCUSSION • FURTHER EXPERIMENT： • WesternBlot • MORE DNA • Dehydrate Liver • Positive Control

  13. DISCUSSION 阅读 严谨 毅力

  14. ACKNOWLEDGEMENT 感谢陈铭老师的指导与鼓励 感谢顾师兄、王师兄的帮助和建议 感谢实验室张老师和侯老师的工作！

  15. Thank you!

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