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Techniques de base de la vitroculture

Techniques de base de la vitroculture. Vitroculture et vitrométhodes. Aspects techniques. Organisation du laboratoire. Repiquage en conditions stériles. Préparation des milieux et stérilisation. Chambre de culture. Laverie. Conditions de culture. Stérilisation des explants. Ethanol

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Techniques de base de la vitroculture

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Presentation Transcript

  1. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Techniques de base de la vitroculture Vitroculture et vitrométhodes

  2. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Aspects techniques Organisation du laboratoire Repiquage en conditions stériles Préparation des milieux et stérilisation Chambre de culture Laverie

  3. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  4. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  5. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  6. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Stérilisation des explants • Ethanol • Hypochlorite de sodium ou calcium • Peroxyde d’hydrogène • Nitrate d’argent

  7. 1/ Ethanol 10 s 2/ Ca(OCl)2 7%, 10 mn 3/ 3 lavages H2O stérile Choix de l ’échantillon Découpage de l’explant et mise en culture Protocole de stérilisation des explants végétaux

  8. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Milieu de culture • Eau • Agents solidifiants : • agar • phytagel : • polymère d’origine bactérienne (acide glucuronique, rhamnose et glucose) • translucide • !! Interférences avec la kanamycine !!

  9. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Milieu de culture • Source de carbone ? In vitro, la majorité des cultures végétales sont hétérotrophes Choix de la source carbonée • Saccharose • glucose • maltose • Cas par cas : • substances de croissance • génotype

  10. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Milieu de culture • Éléments minéraux • Macroéléments : N,P,K, Ca, Mg, S ex : rapport NO3- / NH4+ • Microéléments : autres oligoéléments Utilisation de nitrate d’argent comme antagoniste de l’éthylène

  11. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Substances de croissance • Auxines (dérivés du tryptophane) • Cytokinines (dérivés de l’adénine) • Gibbérellines (diterpènoïdes)

  12. CH CO H 2 2 N OCH CO H 2 2 H CH CO H 2 2 Cl Cl Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Substances de croissance • Les auxines • Naturelle : • Acide Indole Acétique = IAA • Synthétiques : • Acide Naphtalène Acétique • 2,4-D (acide dichlorophenoxyacétique)

  13. Diffusion des hormones - dominance apicale - stimulation de la rhizogenèse Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Mode de production des auxines Site de production: bourgeon apical

  14. Elles inhibent l’élongation de la tige feuillée et le débourrement des bourgeons axillaires Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Rôle des auxines Au niveau cellulaire : elles stimulent l’élongation Au niveau tissulaire : Elles stimulent la croissance racinaire pour de faibles concentrations (sauf le 2,4-D)

  15. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Substances de croissance • Les cytokinines • Naturelles • Isoprénoïd CK (ex: zéatine) • Aromatic CK (ex: BA) • Synthétiques • Kinétine • Benzyl AdénoPurine (BAP)

  16. Transport vers les sites d ’action : - levée de dominance apicale - débourrement des bourgeons axillaires Site de production: Racines S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Mode de production des cytokinines

  17. Au niveau tissulaire : En général, inhibition de la croissance d’apex racinaires Induction de l’activité des méristèmes apicaux des organes aériens S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Expression de CYCD3 en fonction des traitements hormonaux chez A.thaliana Rôle des cytokinines Au niveau cellulaire : elles stimulent la division cellulaire via l’induction de Cyclines Riou-Khamlichi et al., 1999 Science Surexpresseur de CYCD3

  18. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Substances de croissance • Gibbérellines (Acide gibbérellique) • Noyau ent-Kaurène (issu du geranyl-geranyl PP)

  19. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales • Gibbérellines (Acide gibbérellique) • Effets complexes : • Stimulation croissance internodale, expansion des feuilles • Inhibition de la croissance racinaire à la lumière • Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité

  20. Conditions de culture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Milieu de culture • Éléments organiques divers • Acides aminés (glycine, cystéine…) • Vitamines (thiamine, acide nicotinique, acide folique…) • Mélanges organiques complexes • Antioxydants

  21. Coupure Cellules indifférenciées callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Comment obtenir un cal et des cellules indifférenciées ?

  22. callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  23. callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  24. callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  25. callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  26. organogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  27. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Organogenèse Skoog et Miller (1957) • Régénération d’organes à partir d’un cal [Cytokinine] Callogenèse Caulogenèse Rhizogenèse [Auxine]

  28. Méthode classique 1 – Explants sur un milieu inducteur de cal = CIM 2 – Transfert quelques jours plus tard sur un milieu inducteurs de tiges feuillées = SIM 3 – Transfert après quelques semaines sur un milieu inducteur de racines Pour un exemple détaillé lire l’article “classique” de Valvekens et al. 1987 PNAS sur la méthode d’Agrotransformation de racines d’Arabidopsis S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

  29. S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

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