Métodos y técnicas de estudio de la función reproductiva

1. Métodos y técnicas de estudio de la función reproductiva Dr. Hector Godoy Morales Profesor Titular Dr. Alfredo Ulloa Aguirre Profesor Adjunto Presenta: Dr. Horacio Alvarado Delgado R1BR

2. Principios de Evaluación Hormonal • Métodos Inmunológicos • Anticuerpos • Medición de cantidades muy pequeñas de hormonas • Reacción antígeno – anticuerpo • INMUNOENSAYOS • ENSAYOS INMUNOMETRICOS

3. INMUNOENSAYOS

4. Ensayos Inmunometricos

5. Ensayos inmunometricos Inmunolite

6. Evaluación Hormonal • Sensibilidad • Capacidad de medir exactamente el valor menor posible • Especificidad • Capacidad de medir exactamente unicamente la hormona en cuestión sin reacción con otras hormonas o substancias

7. Evaluación Hormonal • Problemas con especificidad • Hormonas proteicas • Isoformas • Hormonas esteroides • Moléculas de tamaños muy pequeños • Cantidades de hormona pequeña • Mujeres = testosterona

8. Validación y control de calidad de Inmunoensayos • Validación del ensayo • Antes de usar debe ser validado • Exactitud • Precisión • Sensibilidad • Especificidad

9. Exactitud del ensayo Define el grado en que una medición dada está deacuerdo con el valor real • Métodos para establecer la exactitud • Encontrar el paralelismo entre la curva estándar del ensayo y sus diluciones seriadas de muchas muestras que contienen altas concentraciones de lo que se va a analizar. • La recuperación de patrón añadido, en los diferentes niveles, a partir de muestras de pacientes

10. Precisión Es la variabilidad que existe cuando múltiples mediciones de un compuesto son realizadas en la misma muestra. • Se determina • Coeficiente de variación • Precisionintraensayo • Precisión interensayo

11. Precisión • Coeficiente de variación (%) • Precisión Intraensayo • Se evalúa midiendo el análisis en muestras repetidas del mismo ensayo. • Precisión Interensayo • Análisis en muestras repetidas, cada una incluida en diferentes ensayos SD CV = X 100 media de determinaciones repetidas de una prueba

12. Especificidad Grado de interferencia de una reacción cruzada que se encuentra a partir de otras substancias del análisis • Medición • Reacción cruzada del anticuerpo se compara con la curva de dosis respuesta estándar obtenida de los compuestos que están presentes en la misma muestra de la substancia analizada y que pueda unirse a los anticuerpos

13. Especificidad Grado de interferencia de una reacción cruzada que se encuentra a partir de otras substancias del análisis • Medición • Comparar los valores analizados de un grupo de muestras medidas por un método especifico de inmunoensayo, el cual es obtenido por un método clásico.

14. Sensibilidad Se define como la cantidad mas pequeña de substancia que se requiere para ser distinguida de cero • Depende de la precisión de la curva estándar, la cual se mide analizando 10 replicas de cada concentración estándar y de la estándar “zero”. Esto permite el cálculo de la cantidad media de marcador de anticuerpo límite, lo que corresponde a cada concentración estándar

15. Control de calidad de un ensayo • Parámetros de control de confiabilidad de un inmunoensayo • Control de calidad externo • Control de calidad interno • Curva estándar • Cuenta total • Fijación no específica • Fijación cero estándar • Pendiente • Intecepción de “y” • the doses of the standard at which the percentage of label-bound substance is equal to 20, 50 y 80% • Lo que se mide en las muestras

16. Sistemas de enzayos comerciales • Inmunoensayo de fluoresencia de disosciación mayor de lanátidos • Sistema inmunolite • Sistema IMx

17. Inmunoensayo de fluorecencia de disociación mayor de lanátidos • Fluorocromos • Emiten luz visible durante la exitación con radiación • Isotiocinato • Europium • Elemento de la serie de lanátidos, que es quelado a un compuesto substituible. • Para mejorar la florescencia, el europium quelado se disocia a un complejo que baja de pH y forma un nuevo quelato, que se fija a la solución para prevenir el enfriamiento

18. Inmunoensayo de fluorecencia de disociación mayor de lanátidos • Fase solida • Dos ensayos fluoroinmunométricos • Técnica de sandwich • Usa dos anticuerpos monoclonales

19. Inmunoensayo de fluorescencia de disociación mayor de lanátidos • Flurecsencia depende de la cantidad de concentración en una muestra

20. Sistema Inmunolite • Usa tecnología quimiolumiscente amplificada por enzimas. • Hidrólisis de un substrato quimiolumiscente estable • Fosfato adamantildioxetano • Enzima • Alcalin fosfato

21. Sistema Inmunolite Fosfato de Adamantildioxetano Alcalin fosfato Anión adamantildióxetano Emisión de luz

22. Sistema IMx • Analizador de inmunoensayo automatizado, que incorpora • Inmunoensayo de micropartículas (MEIA) • Para moléculas de gran peso • Hormonas proteicas • Fluorometría • Inmunoensayo de polarización fluorescente (FPIA) • Para moléculas de bajo peso • Para hormonas esteroideas • Polarización óptica fluorescente

23. Sistema IMx

24. RIA combinado con bioensayos • El primer RIA – bioensayo • Dafuet.al. • Midieron concentración de testosterona en células de Leyding dispersas bajo la influencia de LH o hCG. • Ventajas • Actividad biológica de las hormonas cambia. • Método de elección • Ausencia de hormona por actividad biológica

25. Médición de gonadotropinas • FSH Y LH = IU • Preparaciones • LER 907 • 2nd IRPHMG • RIA • Baja sensibilidad y especificidad • PULSATIBILIDAD

26. Medición de gonadotropinas • Si se esperan bajos niveles • IRMA • IFMA • ICMA • LH • reacción cruzada con hCG • Pulsatibilidad (60 – 90 minutos) • Presición: toma muestra cada 15 – 20 minutos

27. Medición de gonadotropinas FSH Incrementada Levodopa Ketoconazol Disminuida Estrogenos Fenotiazidas LH Incrementada Ketoconazol Disminuida Esteroides Fenotiazinas Digoxina Propanolol β-hCG 5 – 20ug Embarazo Tumor productor de bhcg Secreciónhipofisiaria normal Interferencia

28. Niveles Sanguíneos de FSH y LH en la mujer • LH – FSHfasefolicular • RIA 4 – 15 mIU/ml • ICMA: • NO: falla hipotalámica o hipofisiaria o pubertad • Se usan ensayos de tercera generación. Variaciones en laboratorios LH: 8.2 ± 2.1 mIU/ml (4 – 12.4 mIU/mL) FSH: 8 ± 1.8 mIU/ml (4.4 – 11.6 mIU/mL) Razón FSH/LH: 1:1

29. Niveles sanguíneos de LH y FSH en la mujer • Medio ciclo • LH: incrementa cuatro a seis veces • FSH: dos a tres veces • Fase lútea • LH y FSH: mismo valor que fase folicular

30. Niveles sanguíneos de LH y FSH en la mujer • Pacientes pediátricos • Niveles menores • Tasa LH:FSH <1 (mas secreción FSH) • Uso de IRMA o ICMA de 3era generación • Pediátricos • Pubertad precoz (LH: > 0.6 mUI/ml) • HipogonadismoHipogonadotripico

31. Niveles sanguíneos de LH y FSH en la mujer • Perimenopausia • FSH LH • Postmenopausia • FSH y LH • Senectud • LH =

32. Niveles sanguineos de LH y FSH en la mujer • LH y relación FSH:LH • LH y FSH SOP Falla ovárica prematura

33. Pruebas dinámicas para la evaluación de gonadotropinas • Prueba de hormona estimulante de gonadotropinas • GnRH sintética para estimular FSH y LH Diferenciar entre causas hipotalámicas o hipofisiarias de deficiencia de gonadotropinas

34. Prueba de GnRH 100 ug IM diario de GnRH por una semana Baja respuesta = Problema Hipotalámico Usada para probar la maduración del eje H-H-O 2 muestras basales separadas por 15 minutos 25 o 100 ug IV GnRH Muestras 20,30, 60, 90 y 120 min

35. Prueba de GnRH • 100 ugGnRH, pico de LH • Niñas: > 15 mIU/ml • Niños: > 25 mIU/ml RIA 100 ugGnRH, pico de LH > 8 mIU/ml GDPP ICMA • 100 ugGnRH, pico de LH • Niñas: > 6.9 mIU/ml • Niños: > 9.6 mIU/ml IFMA

36. Prueba de GnRH • Único método valido • Pulsatibilidad espontanea de GnRH • Fines de investigación |

37. Prueba con citrato de clomifeno FSH y estradiol día 3 100 mg clomifeno días 5 - 9 + = cualquier valor arriba del umbral que marque el laboratorio como positiva (10 – 12 mIU/ml) FSH día 10 Para medir reserva ovárica

38. Medición de Prolactina • Medida por RIA o IRMA • Hombre: 15 – 20 ng/mL • Mujer: 20 – 25 ng/mL • Influenciada por • Estrógenos • Medicamentos • Fenotiazinas • Metoclopramida • Estrés • Comida • Estimulación mamaria • Punción de vena

39. Medición de Prolactina • Cambios diurnos • Incremento después de las comidas • Muestra: al media mañana • Hiperprolactinemia • 10% sin diagnóstico • Enfermedades autoinmunes • Precipitación con polietilen-glicol • (elevación por PRL monomérica + PRL autoanticuerpo)

40. Medición de Prolactina

41. Pruebas dinámicas de evaluación de PRL • Usadas antes de TAC o RM • TRH • Estimula la secreción de TSH • Usada para medir secreción hipofisiaria de PRL Pacientes con prolactinoma, no presentan incremento en PRL después de la estimulación con TRH

42. Pruebas dinámicas de elevación de PRL • Prueba con TSH: para definir entre • Formas funcionales de hiperprolactinemia • Adenoma Hiofisiario secretor de PRL • TSH 200ug IV • Muestras: 30, 60 y 90 minutos • PRL = incremento 100% • Metoclopramida 10 mg IV • Muestras: 30, 60, 90 y 120 minutos • PRL = 100 ng/mL, 60 y 120

43. Medición de estradiol y otros estrógenos • RIA • Bajos Niveles • Se extraen con solventes orgánicos y se separan por cromatografía. • Estriol • RIA en suero • Métodos espectofotometricos • RIA en orina

44. Medición de estradiol y otros estrógenos En hombres: Evaluación estradiol: Hipogonadismo y ginecomastia Obesidad: Aumento de estrógenos

45. Medición de Progesterona • Progesterona medida por una variedad de inmunoensayos • Especificidad alta y depende de la reacción cruzada con la 17 α OHP

46. Niveles sanguíneos de progesterona y evaluación de la ovulación • Fase folicular: < 1.5 ng/mL • Incremento posterior a pico LH y tiene pico maximo 6 – 8 días después de ovulación. • Postmenopausia: < 0.5 ng/mL • Para evaluación ovulación • Fase media – lutea (21 – 22 ciclo) • > 7 ng/mL. • En embarazo: 40 ng/mL • A término: 150 ng/mL • 6 – 8 semanas: < 10 ng/mL = Ectópico

47. Medición de andrógenos • Andrógenos en la mujer • Ovarios • Glandula suprarrenal • Compartimiento periferico • Se miden varios andrógenos • Testosterona sérica • Ovario ,2/3 de conversión periférica androstenediona • Sulfato de DHEA • Suprarrenal

48. Medición de Andrógenos • Testosterona sérica • RIA o ICMA • Costoso • Baja especificiad • Sobreestimación de los valores • Testosterona no fija = testosterona libre • Se calcula el pocentaje libre de SHBG • 75% testosterona fiaja a SHBG • Fija a albúmina • LIbre

49. Medición de Andrógenos • Testosterona libre • Se mide relación entre testosterona y SHBG TL = (T (ng/ml) x 3.467) SHBG X 100

50. Medición de andrógenos • Otros andrógenos útiles • 11 b- hidroxyandrostenediona • Porducción suprarrenal de androstenediona • Productos de 5 a-reductasa • 3 a- glucoronil - androstenediol • Refleja el metabolismo periferico de T en hirsurtismo