KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

2. Đềtài: Nghiêncứubiểuhiện gen mãhóakhángnguyên GP 120 của virus HIV phân type B lưuhànhtạiViệt Nam Ngườihướngdẫn : PGS.TS ĐinhDuyKháng Sinhviên : Phạm Thu Trang

3. Tìnhhình HIV trênthếgiới 2009

4. Ướctínhđếnnăm 2011, Việt Nam cókhoảng 311.500 ngườibịnhiễmbệnh. • TạiViệt Nam tínhđếnngày31/12/2010 • 183.938 người • 44.938 người • 49.477 người

6. Phânbốcácphân type HIV-1 M theovùngđịalý (2008)

7. Glycoprotein gp 120

8. Glycoproteinvỏ gp 120 của virus HIV

9. Phứchợp gp120-CD4-đồng thụthể

10. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

11. Vậtliệu • Plasmid mang gen gp120của virus HIV phân type B lưuhành ở Việt Nam (mẫusố 6, QuảngNinh) đượctáchdòngthànhcôngtạiPhòng Vi sinhvậthọcphântử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN. • Cáchóachất, sinhphẩmvàtrangthiếtbịtạiPhòng Vi sinhvậthọcphântử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN.

12. Phươngphápnghiêncứu • Nhânbản gen mãhóa protein gp120B của virus HIV bằngphươngpháp PCR. • Gắnsảnphẩm PCR vào vector. • Biếnnạp DNA plasmid vàotếbàoE.coli. • Cắt DNA bằng enzyme giớihạn. • Xácđịnhtrìnhtự gen bằngmáygiảitrìnhtự gen tựđộng • Biểuhiện gen trongtếbàoE.colitáitổhợp. • Tinhsạch protein táitổhợpbằngcộtáilực Ni2+ . • Phươngpháp Western Blot.

13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

14. Thiếtkế vector biểuhiện pET32a(+) mang gen gp120B

15. Khuếchđại gen gp120B_EXbằngcặpmồibiểuhiện ĐC1: Thang DNA chuẩn 1kb ĐC2: sản phẩm PCR.

16. Tạo vector táitổhợp pET32a(+) mang gen gp120B_EX ĐC 1: Plasmid gốc vector pET32a(+) ĐC 2-12: DNA plasmid cókhảnăngmang gen gp120B_EX ĐC1: Thang DNA chuẩn 1 kb. ĐC2-6: Các dòng plasmid 3, 4, 8, 10, 12 cắt bằng BamH I và Xho I ĐC7: Đối chứng (đoạn gen gp120B_EX)

17. Tinhsạch DNA plasmid ĐC1-3: Tươngứngvớidòng plasmid táitổhợpsố 4, 10, 12

18. Gen gp120B_EXtrong vector biểuhiện pET32a(+) đãđượcgiảitrìnhtự

19. Kiểmtrakhungđọccủa gen gp120Btrong vector pET32a(+)

20. Biểuhiện gen gp120Btrong vi khuẩnE.colichủng BL21 StarTM (DE3) ĐC 1: Thang Protein chuẩn ĐC 2,4: Mẫukhôngcảmứng ĐC 3,5: Mẫucảmứngbằng IPTG 1mM

21. Kiểmtratrạngtháitồntạicủa protein gp120B táitổhợp M: Thang Protein chuẩn ĐC: Mẫutrướccảmứng C: protein thuđược ở phacặn HT: Mẫu protein thuđược ở phanổi

22. Ảnhhưởngcủanồngđộ IPTG ĐC M: Thang Protein chuẩn ĐC 0: Mẫukhôngcảmứng ĐC 0,25; 0,5; 1: Mẫucảmứngbằng ITPG tươngứngnồngđộ 0,25mM, 0,5mM, 1mM

23. Ảnhhưởngcủathờigiannuôicấy ĐC M: Thang Protein chuẩn ĐC 0: Mẫukhôngcảmứng ĐC 1, 2, 3,4: Mẫucảmứngvớithờigiantươngứng 1h, 2h, 3h, 4h

24. Tinhchế protein gp120B táitổhợp ĐC 1: Thang protein chuẩn (Fermentas) ĐC 2-8: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột sau khi tinh sạch ĐC 9: Dịch phá tế bào bằng siêu âm, ĐC 10: Dịch chảy qua cột

25. Nghiên cứu khả năng phản ứng của GP120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng Western blot Hình A: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh dương tính với HIV Hình B: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh âm tính với HIV ĐC 1: Thang protein chuẩn ĐC 2: Protein tái tổ hợp GP120B ĐC 3: Protein tái tổ hợp Thioredoxin

26. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN 1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện để biểu hiện gen gp120 phân type B của HIV lưu hành ở Việt Nam. 2. Đã biểu hiện thành công gen mã hóa protein gp120 ở vi khuẩn và đã tìm được điều kiện tối ưu để biểu hiện. 3. Đã tinh sạch được kháng nguyên GP120 phân type B có độ tinh sạch. Sau khi tinh sạch kháng nguyên vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên, phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV dương tính. II. KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP120 tái tổ hợp từ phân type B để chế tạo kit chẩn đoán HIV.

27. XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN!

32. Vòngđờicủa virus HIV

34. Cácphươngpháppháthiệnkhángthể • Ápdụng - Giámsátdịchtễ. - Chẩnđoánnhiễm HIV trên 18 thángtuổi. • Cácphươngpháp : - Huỳnhquangmiễndịch. - Enzyme liênkếtmiễndịch: ELISA (Enzyme Linked ImmunoadsorbentAsay). - Kỹthuậtngưngkết vi lượngthụđộng (Serodia). - Kỹthuậtxétnghiệm Western Blot. -Kỹthuật RIPA (Radioimmuno precipitation assay).

35. Nhữngphươngpháppháthiệntrựctiếpkhángnguyên • Ápdụng - Pháthiệnnhiễm HIV ở trẻsơsinhđượcsinhratừmẹnhiễm HIV - Pháthiệnsớmgiaiđoạnmớinhiễm HIV (giaiđoạncửasổ) hoặckhikếtquảpháthiệnkhángthểkhôngrõràng. - Theo dõidiễnbiếnbệnh, đánhgiáhiệuquảđiềutrịthuốckháng virus trongcácmụcđíchnghiêncứukhác. • Cácphươngpháp: - Kỹthuật PCR (Polymerase Chain Reaction) - Pháthiệnkhángnguyên P24 của virus trongmáu.

36. Nuôicấytừcáclymphobàođểphânlập virus • Nguyênlý: Táchtếbàođơnnhântrongmáubệnhnhânvànuôicấychungvớitếbàođơnnhâncủangườilànhđãđượchoạthóatrongmôitrườngnuôicấy PHA (phytohemagglutinin) thíchhợp. • Xácđịnhsựnhânlêncủa virus bằngkỹthuật [5] : • ELISA pháthiệnkhángnguyên P24 trongnướcnổimôitrườngnuôicấytếbào. • Dùngđồngvịphóngxạpháthiện enzyme saochépngượccủa virus (RT) • Phươngphápnàydùngchủyếulàđểnghiêncứu, cònđểchuẩnđoánthì ở giaiđoạnmớinhiễmrấtkhóphânlập, vìkhihuyếtthanhcókhángthểkháng HIV thìviệcphânlậpđược virus làrấthạnhữu.

37. ChẩnđoánsinhhọccósuygiảmmiễndịchvàcórốiloạnmiễndịchChẩnđoánsinhhọccósuygiảmmiễndịchvàcórốiloạnmiễndịch • Dấuhiệu tin cậyvàtrựctiếpnhấtlàgiảm TCD4+ bìnhthường 450-1280/mm3; TCD8+ bìnhthường 258-800/mm3. • Dấuhiệugiántiếpvàcũng tin cậylàtỷlệ TCD4+/ TCD8+ giảm, bìnhthườnglà 1,4-2,2. • Qui định: <400 TCD4+/mm3tiệnlượngxấu, chứngtỏđãsuygiảmmiễndịchđángkể. < 200 TCD4/mm3suygiảmmiễndịchnghiêmtrọng, giảmlympho B, bìnhthường 25-280/mm3. • Theo dõikhángnguyên P24: • Vừacógiátrịpháthiệnsớmbệnh 50-70% (+) ở giaiđoạnsơnhiễm. • Khicóhộichứng AIDS đầyđủ 50-70% (+) trởlại. • Bệnhtiếntriểntrầmlặngthìkhángnguyên P24 giảmdầntheothờigian. • Dấuhiệugiántiếpsuygiảmmiễndịch.

38. Nhữngthuốcđiềutrị HIV hiện nay • Triomune-30( or -40);Mỗiviênnénchứa: Stavudine 30 mg(or 40 mg); Lamivudine 150 mg; Nevirapine 200 mg.Cảhaistavudinevàlamivudinehoạtđộngbằngcáchchấmdứtsựtăngtrưởngcủacácchuỗi DNA vàsaochépcácứcchếngượccủa HIV. Nevirapinelàmột non-nucleoside ứcchếsaochépngược. Nóhoạtđộngbằngcáchsaochépngượctrựctiếpứcchế. • Amantadine: Tácdụng ở giaiđoạn 1, tứclàứcchếsựhòanhập virus vàobêntrongtếbàokýchủ. • Ribavirin: Tácdụng ở giaiđoạn 2, tứclàứcchế virus (đặcbiệt virus cúm) tổnghợp RNA củanó, từđóứcchếsựsaochépcủa virus bêntrongtếbào. Cũngthuộcloạinày, Acyleovirứcchếsựtổnghợp DNA của virus Herpes. • Zidovudine (Retrovir, còngọitắt AZT): Ðâylàthuốctrị HIV. Cơchếcủathuốclàứcchếsựphiênmãngược RNA thành DNA của HIV làmcho HIV ngưngpháttriển, khôngsinhsảnđược. CũngthuộcloạinàycòncóDidanosine, Zalcitabine, Lamivudine... • Oseltamivir(Tamiflu): Thuốccótácdụng ở giaiđoạncuối, tứclàngănkhôngcho virus cúmsaochéptrưởngthànhvàphóngthíchrakhỏitếbàobằngcáchứcchế men neuraminidase (chínhlàkhángnguyên N củalớpvỏ virus cúm). • Thuốcứcchế protease: GồmcóIndinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir. Ðâylànhómthuốcphốihợpvới AZT đểtrị HIV. Cơchếcủathuốcứcchế protease làlàmcho men phângiảiđạmcủa HIV khônghoạtđộngđược, đểnókhôngnhânlênnhiều HIV mới. • Gamma globulin và Interferon: Ðâychínhlàcácchấtsinhhọc do cơthểsảnxuấtrađểchốnglại virus. Gamma globulin ngăn virus xâmnhậpvàotếbàovìcóchứakhángthểchốnglạikhángnguyênbềmặtnằmtrênlớpvỏcủa virus. Còn Interferon kháng virus bằngcáchngăncản virus tổnghợp protein, RNA hoặc DNA củanótrongtếbào.

40. Human immune deficiency virus – HIV • Là 1 retrovirus; thuộchọretroviridae. • ThuộcnhómLentivirus.

41. Sơđồphân type virus HIV

42. Hìnhdạngvàcấutrúc virus HIV

43. Cấutrúc genome của virus HIV-1

44. Glycoproteinvỏ gp 120 của virus HIV