1 / 39

HRM & Sanger sekventering

HRM & Sanger sekventering. Ved Peter Böhm Nielsen. Generelt analyseflow. MLPA. Anvendte metoder. HRM & Sanger sekventering. Allel 1. Allel 2. Allel 1. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Allel 2. HR-M analyse Lightscanner. Heteroduplex princip. Heteroduplexer.

redell
Download Presentation

HRM & Sanger sekventering

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. HRM & Sanger sekventering Ved Peter Böhm Nielsen

  2. Generelt analyseflow MLPA

  3. Anvendte metoder HRM & Sanger sekventering Allel 1 Allel 2 Allel 1 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Allel 2

  4. HR-M analyseLightscanner

  5. Heteroduplex princip Heteroduplexer Homoduplexer A T A T G C A C G T G C

  6. LCGreen+ dyeDNA mættende dye

  7. LightScanner (1) 7

  8. LightScanner (2) 8

  9. LightScanner (3) 9

  10. LightScanner data

  11. Sir Frederick Sanger- dobbelt nobelpristager 1958: Nobelpris i biokemi for hans arbejde om proteinstrukturer, specielt insulin. 1980: Nobelpris i kemi for hans arbejde om udredning af base-sammensætning i nucleinsyrer

  12. Genomet som arbejdsplads (1) 3.287.209.763 bp i det humane genom Kendte gener: 21.065 Exomet: 685.053 bp ~ 0,2 % af genomet Transkripter: 193.606 Små varianter: 52.065.239 (SNP, Indel, somatiske mutationer)

  13. Genomet som arbejdsplads (2) OMIM statistik (Online Mendelian Inheritance in Man) Gener i databasen:13.186 Gener og fænotype, koblet, autosomal:145 Fænotype m. kendt molekylær baggrund: 3.194 Fænotype m. ukendt molekylær baggrund: 1.635 Andre, fænotype m. forventet molekylær baggrund: 1.781 NCBI maj 2012

  14. Individuel variation (1)(LDLR) Ensemble release 67 - May 2012

  15. Individuel variation (2) Non-synonyme SNPs Alle SNPs The diploid genome sequence of an Asian individual Wang et al., Nature, 2008

  16. Individuel variation (3) 2012 May 17. Evolution and Functional Impact of Rare Coding Variation from Deep Sequencing of Human Exomes. Tennessen et al. As a first step toward understanding how rare variants contribute to risk for complex diseases, we sequenced 15,585 human protein-coding genes to an average median depth of 111x in 2,440 individuals of European (n = 1,351) and African (n = 1,088) ancestry. We identified >500,000 single-nucleotide variants (SNVs), the majority of which were rare (86% with a minor allele frequency < 0.5%), novel (82%), and population-specific (82%). On average, 2.3% of the 13,595 SNVs each person carries were predicted to impact protein function of ~313 genes per genome, and ~95.7% of SNVs predicted to be functionally important were rare.

  17. Human vs. Chimpanse Ensembl release 67 - May 2012

  18. LDLR sekvens (1) Maj 2009 Maj 2010

  19. LDLR sekvens (2) Feb. 2011 Sept. 2011

  20. LDLR sekvens (3) Maj 2012 Hvordan kan det gå godt ?

  21. dNTP vs ddNTP

  22. Nukleotider dNTP Fluorescerende ddNTP dATP dCTP dTTP dGTP ddATPddCTPddTTPddGTP Sekventering 3´-ACACAGTCTATCTCGTA-5´ 5´-TGTGTCAGATAGAGCAT-3´ Template Primer (F el. R) 5´-TGTG-3´ 3´-CGTA-5´ 3´-ACACAGTCTATCTCGTA-5´ 5´-TGTGT-3´ 5´-TGTGTC-3´ 5´-TGTGTCA-3´ 5´-TGTGTCAG-3´ 5´-TGTGTCAGA-3´ 5´-TGTGTCAGAT-3´ 5´-TGTGTCAGATA-3´ 5´-TGTGTCAGATAG-3´ 5´-TGTGTCAGATAGA-3´ 5´-TGTGTCAGATAGAG-3´ 5´-TGTGTCAGATAGAGC-3´ 5´-TGTGTCAGATAGAGCA-3´ 5´-TGTGTCAGATAGAGCAT-3´

  23. Sekvens-fragmenter GACA* 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC 3´-CTGTCATGTAACCTTTGATC GACAG* GACAGT* GACAGTA* GACAGTAC* GACAGTACA* GACAGTACAT*

  24. Automatisk sekventering – ABI3730

  25. Kapillær-sekventering

  26. Sekventeringsfilm

  27. Sekvens – kapillar-elektroforese

  28. Missense, nonsense og silent mutation- sekvens udseende Reference: Eksempel på polymorfi. Varianten er hyppig i befolkningen.   Patient: Eksempel på punktmutation (sort pil), hvor en base skiftes med en anden.

  29. Deletion / addition- sekvens udseende Reference. Patient: Eksempel på deletion, hvor en base er fjernet. Sekvensmønsteret ændrer karakter er bliver overvejende et ”heterozygot” mønster.

  30. Sekvenser skal sammenlignes med reference

  31. Baggrundstøj- svær vurdering • Dårlig sekvensreaktion – lavt signal • Uspecifik primer-annealing ved sekventeringsreaktion • Dye-overskud – blobs • Forkerte reaktionsbetingelser • Sekventering er kun så god som den foregående PCR.

  32. BRCA2 - exon 5F

  33. BRCA2 - exon 5R

  34. Forward – reverse

  35. Genetisk kode

  36. Case (1) Ung pige får taget status-blodprøver i forbindelse med ambulatoriebesøg med henvisning fra praktiserende læge.

  37. Case 1 (2)F7 exon 8 Arg277His

  38. Case 1 (3)Klinik - artikelsøgning • Arg277His varianten er placeret i et område i proteinet, der har katalytisk aktivitet samt interagerer med tissue faktor (TF). • Det er vist at reagenser, der bruger thromboplastin fra forskellige arter kan have effekt på aktiviteten af FVII. • KFII+VII+X analysen bruger thromboplastin fra kaninhjerne og enkelt KF7 fra human placenta. • KF7’s affinitet til human thromboplastin er normal, hvorimod affiniteten til kaninhjerne er lavere, hvorfor KFII+VII+X analysen er udenfor referenceintervallet. • Konklusion: Patienten har ikke ændret blødningstendens.

More Related