Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih nanočestica i

1. Fototermalnaantitumorskaaktivnostgrafenskihnanočesticai ugljeničnihnanotubapobuđenihzračenjembliske IC oblasti S. Misirlić Denčić, Z. Marković, B. Todorović-Marković, D. Kepić, K. Arsikin, Ž.Stanojević, N. Zogović, M. Dramićanin, V. Trajković

2. Uvod U okolnostima nemogućnosti primene hirurške terapije, selektivna ablacija malignog tkiva toplotom je efikasnaalternativna terapijska metoda. Nažalost, glavne termičke ablativne tehnike (laser,ultrazvuk, mikro-talasi i radio-talasi) ne poseduju same po sebi selektivnost premamalignim ćelijama.

3. Uvod U skladu sa tim, neophodno je povećati osetljivost malignih ćelija nairadijaciju u cilju povećanja efikasnosti i smanjenja toksičnosti pri primeni termalne ablacije tumorskog tkiva. Jedna od mogućih, obećavajućih strategija fototermalne terapije maligniteta je upotrebananočestica u cilju efikasne konverzije energije zračenja bliske IC oblasti u vibracionuenergiju i sledstvenu toplotu koja ubija maligne ćelije.

4. Uvod Upotreba zračenja bliske IC oblasti u opsegu 700-1000 nm za indukciju hipertermije je posebno interesantna, obzirom da biološki sistemi uglavnom nemaju hromofore koje mogu apsorbovati zračenja ovih talasnih dužina.

5. Uvod Ugljenične nanotube (CNT) su cilindrične strukture do nekoliko stotina nanometara u dijametru, dužine nekoliko mikrometara, koje se sastoje od atomski-tankih listića ugljenika koji su zovu grafen. Poslednjih par godina proučavanje osobenosti grafena ukazuje na svojstva koja prete da ugroze dominaciju CNT u nanotehnologijama, i otvaraju mogućnost primene grafena u biomedicini.

6. Uvod Ipak, za razliku od potvrđenog fototermalnog antitumorskog delovanja CNT, efekti grafenskih nanočestica na ćelije tumora do danas nisu razjašnjeni. Samo jedna skorašnja studija (Nano Lett 2010;10:3318) na mišjem modelu je pokazala daintravenski aplikovane grafenske nanočestice smanjuju veličinu tumora nakon hipertermije izazvane zračenjem bliske IC oblasti.

7. Uvod 1. Koji molekularni mehanizmi stoje u osnovi grafenom-posredovanog fototermalnog antitumorskog dejstva? 2. Kakva je fotermalna efikasnost grafena u poređenju sa CNT? Ipak, dva vrlo važna pitanja ostala su do danas bez odgovora:

8. Cilj istraživanja U ovom istraživanju poređeno jefototermalno antitumorsko dejstvo grafenskih nanočestica i ugljeničnih nanotuba pobuđenihkontinualnim IC laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju od 30-300s.

9. Materijal i metode U eksperimentima su korišćene stabilne vodene suspenzije sledećih nanočestica: Polivinil-pirolidin grafenskih nanočestica (GPVP) Ugljeničnih nanotubafunkcionalizovanih sa DNK- (CNTDNA) Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa natrijum dodecilbenzensulfonatom (CNTSDBS)

10. Materijal i metode “Atomic force microscopy” (AFM) merenja su izvršena na AFM mikroskopu (Quesant Instrument Corp. Agoura Hills, CA). UV-vis spektralna analiza nanougljeničnih suspenzija je vršena u opsegu talasnih dužina 500-1100 nm pomoću Avantes UV-vis spektrofotometra na 20°C uz automatsku korekciju za rastvarač (voda).

11. Materijal i metode Iluminacija je vršena kontinualnim IC laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju od 30-300 s. Porast temperature je registrovan termoparom uronjenim u suspenziju tako da nije bio direktnoizložen laserskoj svetlosti. Analiza antitumorskog delovanja nanočestica je izvršena na ćelijskoj liniji humanog glioma (U251).

12. Materijal i metode Za procenu vijabiliteta korišćeno je bojenje kristal violetom (CV) i MTT. Analiza molekarnog mehanizma antitumorskog delovanja nanočestica (apoptoza/nekroza, oksidativni stres i depolarizacija mitohondrija) vršena je primenom protočne citometrije.

13. Rezultati Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala

14. Karakterizacija grafenskih nanočestica Large scale AFM images Small scale AFM images Surface profile

15. Karakterizacija grafenskih nanočestica Analiza dobijenih slika minimalno 200 grafenskih nanočestica je ukazala da se u suspenziji GPVP nalaze kao: “single layer” čestice dijametra do 50 nm “bilayer” čestice dijametra 50-70 nm “multilayer” čestice dijametra 70-360 nm Dominirale su “bilayer” čestice dijametra oko 70 nm debljine 2 nm.

16. Karakterizacija ugljeničnih nanotuba Large scale AFM images Small scale AFM images CNTSDBS Surface profile

17. Karakterizacija ugljeničnih nanotuba Većina nanotuba CNTSDBS je u suspenziji formirala snopove prosečne dužine 1.6 µm, dijametra oko 60 nm i visine 3 nm. Morfologija CNTDNA je bila slična.

18. Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala Na osnovu koncentracije nanomaterijala u vodenoj suspenziji i njihove mase izračunata je koncentracija nanomaterijala. Ona je iznosila oko 1015 grafenskih nanočestica/l u suspenziji koncentracije 20 µg/ml i oko 2 x 1012 CNTSDBS/l u suspenziji iste koncentracije.

19. Rezultati Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

20. CNT više apsorbuju svetlost bliske IC oblasti u odnosu na GPVP. Kontrolni rastvori PVP, DNA i SDBS nisu apsorbovali zračenje bliske IC oblasti. UV-vis analiza absorpcije zračenja bliske IC oblasti od strane ugljeničnih nanomaterijala

21. Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

22. Fototermalna senzitivnost grafena i CNT Suspenzije svih ispitivanih nanomaterijala su pokazale porast temperature nakon ekspozicije zračenju bliske IC oblasti koje je bilo zavisno od njihove koncentracije kao i od dužine trajanja ekspozicije. Grafenske nanočestice su pod istim uslovima generisale veći porast temperature u poređenju sa CNT!!!

23. GPVP CNTDNA ∆TCNT~ 18°C ∆TG~ 35°C 65 48 ∆TG/ ∆TCNT~ 2

24. GPVP CNTSDBS ∆TCNT~ 19°C ∆TG~ 35°C 65 49 ∆TG/ ∆TCNT~ 2

25. Fototermalna senzitivnost grafena i CNT Sa druge strane, kapacitet povećanja temperature nakon apsorpcije zračenja bliske IC oblasti je bio skoro identičan za oba tipa CNT. Iz ovoga se može zaključiti da način preparacije ovih nano suspenzija ne utiče na njihovu fototermalnu senzitivnost. Veća fototermalna efikasnost grafenskih nano čestica verovatno se može objasniti njihovom boljom disperznošću

26. Uzimajući u obzir termodinamička, optička i geometrijska svojstva ugljeničnih nano materijala, upotrebili smo sledeće jednačine: ∆Q = toplota m = masa nanočestice c = toplotni kapacitet ∆T = porast temperature N = broj čestica u suspenziji m1 = masa reprezantativnog grafenskog “bilayer”-a tj. ugljeničnog snopa nano tuba A = apsorpcija zračenja (808 nm) S = površina nano materijala koja apsorbuje zračenje Ef = efikasnost apsorpcije (2.3% za “layer” grafena tj. 20% za snop CNT) Fototermalna senzitivnost grafena i CNT (1) (2)

27. Fototermalna senzitivnost grafena i CNT Aproksimovali smo da je razvijena toplota nakon zračenja nanočestica i CNT bliskom IC oblsti istog reda veličine. Na osnovu jednačina (1) i (2) izvedena je jednačina za odnos relativnog porasta temperature za grafenske nanočestice i CNT: dCNT = prosečan dijametar snopa CNT hG = visina grafenske nanočestice

28. Fototermalna senzitivnost grafena i CNT Izračunata vrednost odnosa ∆TG/ ∆TCNT je ~ 3.5 i slična je eksperimentalno dobijenoj vrednosti ~ 2. Dakle, iako CNT imaju bolju fototermalnu senzitivnost, generišu manju količinu toplote u odnosu na grafenske nanočestice. CNT, dakle, imaju tendenciju da agregiraju i formiraju snopove usled čega su u rastvoru manje dispergovane od grafena.

29. Rezultati Fototermalna antitumorska efikasnost grafena i CNT

30. Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije Dozno i vremenski zavisna citotoksičnost prema U251 ćelijama glioma

31. Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije GPVP CNTDNA U skladu sa izmerenim skokom temperature nakon primene zračenja bliske IC oblasti, grafenske nanočestice su pokazale nekoliko puta bolju efikasnost u ubijanju tumorskih ćelija u odnosu na CNT !!!

32. Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije

33. Rezultati Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja

34. Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja Nekroza i apoptoza su dva glavna modaliteta ćelijske smrti koja se u potpunosti razlikuju po mehanizmu nastanka i morfološkim promenama koje ih prate. Nekrozu karakteriše gubitak integriteta ćelijske membrane, stimulacija imunološkog odgovora i oštećenje okolnih zdravih ćelija. Apoptozu karakteriše fragmentacija nuklearne DNK u odsustvu oštećenja membrane, koja eksponira fosfatidilserin.

35. Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)

36. Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja Test aktivnosti LDH je ukazao na porast permeabiliteta ćelijske mebrane u 50% ćelija (49.2 ± 17.3; n=2) Može se zaključiti da nekroza nije jednini mehanizam fototermalnog antitumorskog delovanja grafena.

37. FACS analize (morfologija ćelija) 24h APOPTOZA Smanjenje veličine ćelija Porast granuliranosti ćelija

38. FACS – PI (fragmentacija DNK) 24h

39. FACS – Ann/PI (eksternalizacija fosfatidilserina) 24h NEKROTIČNE KASNA APOPTOZA Ann+/PI+ Ann+/PI+ Ann-/PI+ Ann-/PI+ Ukupan broj Ann+ ćelija u kontroli 9.4% a u tretmanu 95.5% Ann+/PI- Ann+/PI- Ann-/PI- Ann-/PI- ZDRAVE RANA APOPTOZA

40. FACS – ApoStat (aktivacija kaspaza) 24h *p< 0.05 ANOVA U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)

41. FACS – DePsi (depolarizacija mitohondrija) 4h *p< 0.05 ANOVA Gubitak mmp (DΨ)

42. FACS – DHR (produkcija ROS) 4h *p< 0.05 ANOVA

43. FACS – DHE (produkcija superoksida) 4h *p< 0.05 ANOVA

44. Zaključci: Grafenske nanočestice pokazuju fototermalno antitumorsko dejstvo nakon pobuđivanja zračenjem bliske IC oblasti. Bolja disperznost i manja veličina grafenskih nanočestica je odgovorna za superioran fototermalni antitumorski efekat u odnosu na CNT Mehanizam antitumorskog delovanja je kombinacija apoptoze i nekroze usled indukcije oksidativnog stresa i oštećenja mitohondrija.

45. Zaključci: S obzirom na veliku površinu, malu toksičnost i jeftinu proizvodnju, grafenske nanočestice mogu biti potencijalni kandidati za fototermalnu terapiju maligniteta.

46. REALIZATORI ISTRAŽIVANJA Katarina Arsikin Aleksandar Pantović Rukovodilac: Vladimir Trajkovic