IV LEZIONE
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IV LEZIONE. Dati d'espressione genica: ESTs SAGE Microarray NCBI GEO. ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico

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IV LEZIONE

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Presentation Transcript


Iv lezione

IV LEZIONE

  • Dati d'espressione genica:

    • ESTs

    • SAGE

    • Microarray

    • NCBI GEO


Iv lezione

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE

  • Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico

  • L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali

  • In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni


Iv lezione

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

  • Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine

  • Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione

  • Principali tipi di regolazione:

    • Controllo epigenetico

    • Controllo trascrizionale

    • Controllo post-trascrizionale


Iv lezione

  • METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA

  • Sequenziamento sistematico di ESTsda librerie di cDNA

  • SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

  • cDNA microarrays


Iv lezione

“One-gene approach”

Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ?

Real Time PCR

PCR semiquantitativaIbridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot)Ibridazione in situ

“Large-scale approach”

Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ?

Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ?

Profilo d’espressione del genoma(TRASCRITTOMA)


Iv lezione

EST

EST SEQUENCING

mRNA of different genes

cDNA LIBRARY


Iv lezione

EST

  • Il sequenziamento del DNA “codificante” si basa sulla purificazione dell'RNA messaggero da cellule o da campioni di tessuto e sulla sua retrotrascrizione in vitro in una sequenza di DNA complementare (cDNA).

  • In genere i cDNA vengono frammentati e clonati in vettori batterici. Si ottengono in questo modo delle collezioni di batteri, nelle quali ogni colonia contiene un inserto corrispondente ad un frammento di sequenza di un gene espresso, dette librerie di cDNA.


Iv lezione

EST

Utilità delle EST

  • Scoperta di nuovi geni

  • Mappaggio di nuovi geni

  • Identificazione degli esoni lungo estese sequenze genomiche (Gene Prediction)

  • Studio dello splicing alternativo


Iv lezione

EST

  • Una libreria di cDNA, che viene preparata dal messaggero contenuto nelle cellule di uno specifico tessuto, può essere considerata come un'istantanea che riproduce la composizione della popolazione dei messaggeri presenti nel tessuto in un particolare momento dello sviluppo dell'organismo e in determinate condizioni fisiologiche.

  • Le librerie di cDNA in cui i cloni da sequenziare vengono scelti in modo casuale e sulle quali non vengono effettuate né operazioni di sottrazione né di normalizzazione, possono essere usate per descrivere, sia qualitativamente siaquantitativamente, lapopolazione dei messaggeri.


Iv lezione

EST


Iv lezione

EST


Iv lezione

EST


Iv lezione

EST


Iv lezione

EST

UniGene Human Release Statistics

Total sequences in clusters: 3115711

Total number of clusters sets: 95928

22094sets contain at least one known gene

94710sets contain at least one EST

20876sets contain both genes and ESTs

ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE

Sample of 12919 ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts

eg. Rhodopsin:

65 retina ESTs  65 / 12919 = 0.503%


Iv lezione

EST


Iv lezione

EST


Iv lezione

SAGE

SAGE Serial Analysis of Gene Expression

SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala con il fine di avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997)

Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi

Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping

Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG)


Iv lezione

SAGE

Si basa su tre principi:

  • una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti, dal momento che una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto (12bp)

  • le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate in modo automatizzato

  • il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente.


Iv lezione

SAGE

Una TAG e’ una sequenza di lughezza definita direttamente adiacente al 3’ del sito di restrizione piu’ 3’, nel messaggero da cui proviene, per l’enzima utilizzato (spesso NIaIII)

  • Sintesi DNA a doppia elica a partire dai messaggeri con primer oligo(dT) biotinilato

  • Taglio con enzima di restrizione e isolamento della porzione 3’ del cDNA per purificazione mediante sfere a streptavidina

  • Separazione del cDNA in 2 aliquote, ciascuna ligata con un linker diverso, contenente un sito di taglio per un enzima di restrizione (tagging enzyme) che taglia ad una distanza definita dal sito riconociuto (20bp)

  • Il linker con attaccato un breve tratto di cDNA (9-12 bp) viene rilasciato

  • Ligazione tags a due a due ed eliminazione ditags con due elementi uguali

  • Taglio ditags in modo da creare estremita’ coesive (spaziatore di 4 bp)

  • Ligazione ditags in lunghi concatameri

  • Clonaggio dei concatameri e sequenziamento

  • Analisi automatizzata dei risultati: identificazione di tutte le specie di tags, conteggio della frequenza di ciascuna, assegnazione a sequenze geniche note ed annotazione


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

SAGE

  • Il risultato della SAGE e’ di tipo digitale: una lista di tags e la frequenza di ciascuna di esse

  • La fase in cui si stabilisce la corrispondenza tra tag e gene e’ cruciale per una corretta stima del livello d’espressione del gene

  • La corrispondenza tag-gene non e’ sempre biunivoca, come ci si aspetterebbe

  • Gli errori di sequenziamento hanno effetti molto pesanti sui dati SAGE (1%  10% che ci sia almeno 1 errore su 10 bp)

  • Le assegnazioni tag/EST sono affette da un errore maggiore

  • Nel caso di due tag assegnate al medesimo gene:

    Reliable mapping  correzione per gli errori di sequenza sulle ESTs


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

SAGE


Iv lezione

MICROARRAY

Esperimenti di Microarray

Permettono l’analisi dell’espressione genica di migliaia di geni simultaneamente


Iv lezione

MICROARRAY

Un esperimento


Iv lezione

MICROARRAY

= malato

= sano

Gene 1

Gene 2

Misura dell’espressione

dei geni con i microarray


Iv lezione

MICROARRAY

Analisi dell’immagine

  • Identificazione della posizione degli spot

  • Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot

  • Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot

  • Calcolo del background locale


Iv lezione

MICROARRAY

Elaborazione dei dati


Iv lezione

EST

SAGE

MICROARRAY


Matrice dei risultati con pi condizioni sperimentali

Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali

  • Quali geni sono differenzialmente espressi ?

  • Quali e quanti geni sono coespressi?


Obiettivi dell analisi saranno

Obiettivi dell’analisi saranno…

  • Identificazione geni differenzialmente espressi

  • Identificazione pattern di espressione comuni

  • Identificazione di geni coespressi con geni di funzione nota


Cluster analisi

CLUSTER ANALISI

simili

Identificazione di gruppi di geni con profili di espressione

Simili rispetto a cosa ?

distanza

Definizione di

I geni sono punti nello spazio:

punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme


Cluster analisi1

CLUSTER ANALISI

  • DUE STEPS:

  • Misura di similarita’

    • Diverse misure

    • Standardizzazione dei dati

  • Linking method

    • criterio per stabilire i gruppi

    • Metodi gerarchici e non gerarchici


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