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MAXIMAL METHODISCH

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MAXIMAL METHODISCH. im INTRAnet: tmikpoh.charite.de/methods. DNA-Sequenzierung. MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski. Methoden. Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung. Methoden.

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Presentation Transcript
maximal methodisch
MAXIMAL METHODISCH

im INTRAnet:

tmikpoh.charite.de/methods

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

dna sequenzierung

DNA-Sequenzierung

MAXIMAL METHODISCH

Das Methodenseminar

25.07.2005 Lena Wronski

methoden
Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

methoden4
Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

prinzip
Prinzip

enzymatische Neusynthese von DNA

Analyse der neusynthetisierten DNA

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

prinzips des kettenabruchs
Prinzips des Kettenabruchs

Bausteine der DNA-Neusynthese:

dNTPs (N= A, C, G oder T)

Sequenzreaktion: ddNTPS im Reaktionsmix

bei Einbau keine Verlängerung durch Polymerase Kettenabbruch

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

ddntps
ddNTPs

Didesoxyribunukleosidiphopsphate

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

markierung des abbruchpunktes
Markierung des Abbruchpunktes

Markierung des Primers

Markierung der ddNTPs

  • radioaktiv
  • mit Fluoreszenzfarbstoffen (DyeTerminatoren)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

vorteile der dyeterminatoren
Vorteile der DyeTerminatoren
  • One-Tube Reaktionen
  • keine Termination sites
  • keine markierten Primer nötig
  • Verhältnis dNTPs/ddNTPs bestimmt Sequenzlänge
  • direkte Sequenzierung von PCR-Produkten möglich

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

slide12

Auftrennung der entstandenen Fragmente durch Gelelektrophorese

Kleine DNA-Fragmente laufen schnell, größere bleiben zurück

Vorteil der Laserdetektion:

Endpunktdetektion

größere Fragmente können noch unterschieden werden

lesbare Sequenzlänge nimmt zu

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

ablauf
Ablauf
  • DNA-Präparation
  • (PCR)
  • Aufreinigung des Produkts
  • Sequenzreaktion
  • Aufreinigung
  • Sequenzierung
  • Datenauswertung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

dna pr paration
DNA-Präparation
  • Qualität WICHTIG
    • unbedingt Kit-Protokollen folgen
  • Quantität WICHTIG
    • Photometer
    • Gelabschätzung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

aufreinigung von pcr produkten
Aufreinigung von PCR-Produkten

Abtrennung von überschüssigen Primern,

dNTPs, Salzen

  • Gelsäulen (z.b.QiaQuick PCR-Purification Kit)
  • Verdau mit SAP und Exo1
  • Gelelution
  • Fällung: 4M Ammoniumacetat
  • Filtermembran (Centricon, Microcon)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

sequenzierprimer
Sequenzierprimer
  • 22-24mer
  • Bindungsstelle ca 50bp vor der eigentl.Sequenz
  • Basenzusammensetzung ausgewogen
  • G/C-Gehalt ~50%
  • 3‘Ende: G oder C
  • Tm >50°C
  • evtl PCR-Primer übernehmen?

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

m glichst vermeiden
Möglichst vermeiden:
  • Primer-Dimere
  • Sekundäre Bindungsstellen
  • Sekundärstrukturen
  • Repeats

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

template menge
Template-Menge

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

reaktionsansatz sequenzier pcr
Reaktionsansatz Sequenzier-PCR

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

aufreinigung nach sequenzierreakton
Aufreinigung nach Sequenzierreakton
  • Spin Column/Plate

Zeit zwischen Herstellung und Verwendung?

Ladevolumen?

Zentrifuge, Parameter?

  • Fällung

Temperatur?

Zentrifugation?

Mischen?

Ethanolreste vermeiden!

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

auswertung
Auswertung
  • DNA-Star, Sequence Analysis
  • Sequencher
  • Freeware:

CHROMAS (http://www.technelysium.com.au/chromas.html)

AbiView

(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/abiview/abiview.html

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

gute daten
Gute Daten

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

basecalling
Basecalling

Algorithmus zur „Filterung der Rohdaten“

Achtung!

Basecaller und DyeSet müssen zusammenpassen!

Dyeset richtet sich nach Art des DyeTerminator Mix!

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

chromatogramm
Chromatogramm

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

annotations
Annotations
  • Anmerkungen des Analyseprogramms zu

Signalstärke,

Lauflänge

Spacing (Abstand der einzelnen Signale)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

troubles die h ufigsten ph nomene
Troublesdie häufigsten Phänomene
  • DNA Template-Menge
    • zu viel
    • zu wenig
  • Template-Qualität
    • Kontaminationen
    • Inhibitoren
    • Salze

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

troubles die h ufigsten ph nomene30
Troubles die häufigsten Phänomene
  • Primerqualität

Restprimer

Primer-Dimere

Qualität (Alter? wie oft schon verwendet? Wie oft aufgetaut/eingefroren?)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

troubleshooting parameter zur problemerkennung
TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Chromatogramm

Signalbild

Hintergrund (Rauschen

Reichweite

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

troubleshooting parameter zur problemerkennung32
TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Rohdaten

Intensitäten

unspezifische Signale

Annotations

relative Signalstärke

Spacing

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

zur erinnerung so sehen gute rohdaten aus
Zur Erinnerung – so sehen gute Rohdaten aus

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

sequenzreaktion fehlgeschlagen
Sequenzreaktion fehlgeschlagen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

zu viel template
Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

zu viel template36
Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

zu wenig template
Zu wenig Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

gemischte sequenzen
Gemischte Sequenzen

-mehrere Templates im Ansatz

-mehrfache Primerbindungsstellen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

kontamination durch mangelhafte aufreinigung
Kontamination durch mangelhafte Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

mangelnde aufreinigung
Mangelnde Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

rascher signalverlust
Rascher Signalverlust

GC-/GT-reiche Regionen, Sekundärstrukturen vorhanden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

dye blobs
Dye Blobs

zu wenig Template/Kontaminationen, die Dye-Klumpen bilden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar

slippage abrutschen
Slippage/“Abrutschen“

Sequenz enthält Repeats, Polymerase „rutscht aus“

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ad