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MAXIMAL METHODISCH. im INTRAnet: tmikpoh.charite.de/methods. DNA-Sequenzierung. MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski. Methoden. Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung. Methoden.

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MAXIMAL METHODISCH

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Presentation Transcript


Maximal methodisch l.jpg

MAXIMAL METHODISCH

im INTRAnet:

tmikpoh.charite.de/methods

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Dna sequenzierung l.jpg

DNA-Sequenzierung

MAXIMAL METHODISCH

Das Methodenseminar

25.07.2005 Lena Wronski


Methoden l.jpg

Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Methoden4 l.jpg

Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Prinzip l.jpg

Prinzip

enzymatische Neusynthese von DNA

Analyse der neusynthetisierten DNA

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Prinzips des kettenabruchs l.jpg

Prinzips des Kettenabruchs

Bausteine der DNA-Neusynthese:

dNTPs (N= A, C, G oder T)

Sequenzreaktion: ddNTPS im Reaktionsmix

bei Einbau keine Verlängerung durch PolymeraseKettenabbruch

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Ddntps l.jpg

ddNTPs

Didesoxyribunukleosidiphopsphate

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slide8 l.jpg

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Markierung des abbruchpunktes l.jpg

Markierung des Abbruchpunktes

Markierung des Primers

Markierung der ddNTPs

  • radioaktiv

  • mit Fluoreszenzfarbstoffen (DyeTerminatoren)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Vorteile der dyeterminatoren l.jpg

Vorteile der DyeTerminatoren

  • One-Tube Reaktionen

  • keine Termination sites

  • keine markierten Primer nötig

  • Verhältnis dNTPs/ddNTPs bestimmt Sequenzlänge

  • direkte Sequenzierung von PCR-Produkten möglich

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slide11 l.jpg

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slide12 l.jpg

Auftrennung der entstandenen Fragmente durch Gelelektrophorese

Kleine DNA-Fragmente laufen schnell, größere bleiben zurück

Vorteil der Laserdetektion:

Endpunktdetektion

größere Fragmente können noch unterschieden werden

lesbare Sequenzlänge nimmt zu

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slide13 l.jpg

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slide14 l.jpg

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slide15 l.jpg

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Ablauf l.jpg

Ablauf

  • DNA-Präparation

  • (PCR)

  • Aufreinigung des Produkts

  • Sequenzreaktion

  • Aufreinigung

  • Sequenzierung

  • Datenauswertung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Dna pr paration l.jpg

DNA-Präparation

  • Qualität WICHTIG

    • unbedingt Kit-Protokollen folgen

  • Quantität WICHTIG

    • Photometer

    • Gelabschätzung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Aufreinigung von pcr produkten l.jpg

Aufreinigung von PCR-Produkten

Abtrennung von überschüssigen Primern,

dNTPs, Salzen

  • Gelsäulen (z.b.QiaQuick PCR-Purification Kit)

  • Verdau mit SAP und Exo1

  • Gelelution

  • Fällung: 4M Ammoniumacetat

  • Filtermembran (Centricon, Microcon)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Sequenzierprimer l.jpg

Sequenzierprimer

  • 22-24mer

  • Bindungsstelle ca 50bp vor der eigentl.Sequenz

  • Basenzusammensetzung ausgewogen

  • G/C-Gehalt ~50%

  • 3‘Ende: G oder C

  • Tm >50°C

  • evtl PCR-Primer übernehmen?

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


M glichst vermeiden l.jpg

Möglichst vermeiden:

  • Primer-Dimere

  • Sekundäre Bindungsstellen

  • Sekundärstrukturen

  • Repeats

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Template menge l.jpg

Template-Menge

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Reaktionsansatz sequenzier pcr l.jpg

Reaktionsansatz Sequenzier-PCR

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Aufreinigung nach sequenzierreakton l.jpg

Aufreinigung nach Sequenzierreakton

  • Spin Column/Plate

    Zeit zwischen Herstellung und Verwendung?

    Ladevolumen?

    Zentrifuge, Parameter?

  • Fällung

    Temperatur?

    Zentrifugation?

    Mischen?

    Ethanolreste vermeiden!

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Auswertung l.jpg

Auswertung

  • DNA-Star, Sequence Analysis

  • Sequencher

  • Freeware:

    CHROMAS (http://www.technelysium.com.au/chromas.html)

    AbiView

    (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/abiview/abiview.html

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Gute daten l.jpg

Gute Daten

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Basecalling l.jpg

Basecalling

Algorithmus zur „Filterung der Rohdaten“

Achtung!

Basecaller und DyeSet müssen zusammenpassen!

Dyeset richtet sich nach Art des DyeTerminator Mix!

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Chromatogramm l.jpg

Chromatogramm

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Annotations l.jpg

Annotations

  • Anmerkungen des Analyseprogramms zu

    Signalstärke,

    Lauflänge

    Spacing (Abstand der einzelnen Signale)

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Troubles die h ufigsten ph nomene l.jpg

Troublesdie häufigsten Phänomene

  • DNA Template-Menge

    • zu viel

    • zu wenig

  • Template-Qualität

    • Kontaminationen

    • Inhibitoren

    • Salze

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Troubles die h ufigsten ph nomene30 l.jpg

Troubles die häufigsten Phänomene

  • Primerqualität

    Restprimer

    Primer-Dimere

    Qualität (Alter? wie oft schon verwendet? Wie oft aufgetaut/eingefroren?)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Troubleshooting parameter zur problemerkennung l.jpg

TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Chromatogramm

Signalbild

Hintergrund (Rauschen

Reichweite

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Troubleshooting parameter zur problemerkennung32 l.jpg

TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Rohdaten

Intensitäten

unspezifische Signale

Annotations

relative Signalstärke

Spacing

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zur erinnerung so sehen gute rohdaten aus l.jpg

Zur Erinnerung – so sehen gute Rohdaten aus

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Sequenzreaktion fehlgeschlagen l.jpg

Sequenzreaktion fehlgeschlagen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zu viel template l.jpg

Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zu viel template36 l.jpg

Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zu wenig template l.jpg

Zu wenig Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Gemischte sequenzen l.jpg

Gemischte Sequenzen

-mehrere Templates im Ansatz

-mehrfache Primerbindungsstellen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Kontamination durch mangelhafte aufreinigung l.jpg

Kontamination durch mangelhafte Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Mangelnde aufreinigung l.jpg

Mangelnde Aufreinigung

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Rascher signalverlust l.jpg

Rascher Signalverlust

GC-/GT-reiche Regionen, Sekundärstrukturen vorhanden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Dye blobs l.jpg

Dye Blobs

zu wenig Template/Kontaminationen, die Dye-Klumpen bilden

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Slippage abrutschen l.jpg

Slippage/“Abrutschen“

Sequenz enthält Repeats, Polymerase „rutscht aus“

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Slide44 l.jpg

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