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MAXIMAL METHODISCH. im INTRAnet: tmikpoh.charite.de/methods. DNA-Sequenzierung. MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski. Methoden. Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung. Methoden.

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MAXIMAL METHODISCH

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Presentation Transcript


MAXIMAL METHODISCH

im INTRAnet:

tmikpoh.charite.de/methods

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


DNA-Sequenzierung

MAXIMAL METHODISCH

Das Methodenseminar

25.07.2005 Lena Wronski


Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Methoden

Kettenabbruchmethode nach Sanger

Maxam-Gilbert-Methode

Sequenzierung durch Hybridisierung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Prinzip

enzymatische Neusynthese von DNA

Analyse der neusynthetisierten DNA

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Prinzips des Kettenabruchs

Bausteine der DNA-Neusynthese:

dNTPs (N= A, C, G oder T)

Sequenzreaktion: ddNTPS im Reaktionsmix

bei Einbau keine Verlängerung durch PolymeraseKettenabbruch

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


ddNTPs

Didesoxyribunukleosidiphopsphate

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Markierung des Abbruchpunktes

Markierung des Primers

Markierung der ddNTPs

  • radioaktiv

  • mit Fluoreszenzfarbstoffen (DyeTerminatoren)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Vorteile der DyeTerminatoren

  • One-Tube Reaktionen

  • keine Termination sites

  • keine markierten Primer nötig

  • Verhältnis dNTPs/ddNTPs bestimmt Sequenzlänge

  • direkte Sequenzierung von PCR-Produkten möglich

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Auftrennung der entstandenen Fragmente durch Gelelektrophorese

Kleine DNA-Fragmente laufen schnell, größere bleiben zurück

Vorteil der Laserdetektion:

Endpunktdetektion

größere Fragmente können noch unterschieden werden

lesbare Sequenzlänge nimmt zu

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Ablauf

  • DNA-Präparation

  • (PCR)

  • Aufreinigung des Produkts

  • Sequenzreaktion

  • Aufreinigung

  • Sequenzierung

  • Datenauswertung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


DNA-Präparation

  • Qualität WICHTIG

    • unbedingt Kit-Protokollen folgen

  • Quantität WICHTIG

    • Photometer

    • Gelabschätzung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Aufreinigung von PCR-Produkten

Abtrennung von überschüssigen Primern,

dNTPs, Salzen

  • Gelsäulen (z.b.QiaQuick PCR-Purification Kit)

  • Verdau mit SAP und Exo1

  • Gelelution

  • Fällung: 4M Ammoniumacetat

  • Filtermembran (Centricon, Microcon)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Sequenzierprimer

  • 22-24mer

  • Bindungsstelle ca 50bp vor der eigentl.Sequenz

  • Basenzusammensetzung ausgewogen

  • G/C-Gehalt ~50%

  • 3‘Ende: G oder C

  • Tm >50°C

  • evtl PCR-Primer übernehmen?

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Möglichst vermeiden:

  • Primer-Dimere

  • Sekundäre Bindungsstellen

  • Sekundärstrukturen

  • Repeats

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Template-Menge

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Reaktionsansatz Sequenzier-PCR

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Aufreinigung nach Sequenzierreakton

  • Spin Column/Plate

    Zeit zwischen Herstellung und Verwendung?

    Ladevolumen?

    Zentrifuge, Parameter?

  • Fällung

    Temperatur?

    Zentrifugation?

    Mischen?

    Ethanolreste vermeiden!

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Auswertung

  • DNA-Star, Sequence Analysis

  • Sequencher

  • Freeware:

    CHROMAS (http://www.technelysium.com.au/chromas.html)

    AbiView

    (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/abiview/abiview.html

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Gute Daten

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Basecalling

Algorithmus zur „Filterung der Rohdaten“

Achtung!

Basecaller und DyeSet müssen zusammenpassen!

Dyeset richtet sich nach Art des DyeTerminator Mix!

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Chromatogramm

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Annotations

  • Anmerkungen des Analyseprogramms zu

    Signalstärke,

    Lauflänge

    Spacing (Abstand der einzelnen Signale)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Troublesdie häufigsten Phänomene

  • DNA Template-Menge

    • zu viel

    • zu wenig

  • Template-Qualität

    • Kontaminationen

    • Inhibitoren

    • Salze

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Troubles die häufigsten Phänomene

  • Primerqualität

    Restprimer

    Primer-Dimere

    Qualität (Alter? wie oft schon verwendet? Wie oft aufgetaut/eingefroren?)

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Chromatogramm

Signalbild

Hintergrund (Rauschen

Reichweite

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


TroubleshootingParameter zur Problemerkennung

Rohdaten

Intensitäten

unspezifische Signale

Annotations

relative Signalstärke

Spacing

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zur Erinnerung – so sehen gute Rohdaten aus

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Sequenzreaktion fehlgeschlagen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zu viel Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Zu wenig Template

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Gemischte Sequenzen

-mehrere Templates im Ansatz

-mehrfache Primerbindungsstellen

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Kontamination durch mangelhafte Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Mangelnde Aufreinigung

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Rascher Signalverlust

GC-/GT-reiche Regionen, Sekundärstrukturen vorhanden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Dye Blobs

zu wenig Template/Kontaminationen, die Dye-Klumpen bilden

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Slippage/“Abrutschen“

Sequenz enthält Repeats, Polymerase „rutscht aus“

Maximal Methodisch - das Methodenseminar


Maximal Methodisch - das Methodenseminar


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