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maximal methodisch. www.charite.de/maximalmethodisch. +. Durchflusszytometrie (2): DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen Stephan Lobitz Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK). Wofür braucht man das ?.

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Presentation Transcript

  1. maximal methodisch www.charite.de/maximalmethodisch

  2. + Durchflusszytometrie (2):DNA-Gehalt- und ZellzyklusmessungenStephan LobitzKlinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK)

  3. Wofür braucht man das ? • Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie) • Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate- DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest

  4. Zellzyklus

  5. DNA-Färbung: Grundprinzip Der fluoreszierende Farbstoff Propidiumiodid interkaliert in DNA In einem gewissen Bereich geschieht das stöchiometrisch => Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz

  6. (Ein) Protokoll Man nehme: • 70 % Methanol (EISKALT!!!) • RNAse-Stocklösung (1 mg/ml) • Propidiumjodid-Stocklösung (1 mg/ml) • PBS mit 2 % FKS • 1 diploider Standard als Kontrolle

  7. (Ein) Protokoll • Zellen pelletieren • Unter starkem Vortexen mit eiskaltem Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren • Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben • Erneut pelletieren

  8. (Ein) Protokoll • Pellet in 425 µl PBS resuspendieren • 50 µl RNAse (1 mg/ml) zugeben • 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren • 25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml) zugeben • Messen

  9. (Ein) Protokoll Beim Messen beachten: • 50.000 events registrieren • Flow-Rate auf low stellen • Max. 300 Zellen/Sekunde messen • Beachten, dass DDM-Parameter aktiviert sind (dazu später mehr...)

  10. Wie war das nochmal mit dem FACSen?

  11. Laser Partikel werden mit einem Laser beschossen Detektor Was kommt hinten raus? Was steck ich vorne rein? Partikeleigenschaften

  12. Das gängigste Durchflusszytometer ist der FACSCalibur von BD

  13. FL1 SSC FL2 FL4 FL3 . Blauer Argon-Laser 488 nm RoterDioden-Laser~635 nm FSC FlowCell Der Calibur hat zwei Laser

  14. FL1 SSC FL2 FL4 FL3 . Blauer Argon-Laser 488 nm RoterDioden-Laser~635 nm FSC FlowCell Der Calibur misst: Interne Partikel- komplexität (SSC) FL-1 FL-2 FL-4 FL-3 Partikelgröße (FSC)

  15. Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor Laser Spannung Zeit Laser Spannung Zeit Spannung Laser Zeit

  16. Ein Spannungspuls kann nach3 Kriterien ausgewertet werden Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 0 40 Zeit (µs) Pulsweite (W) = Dauer

  17. Warum ist das SOOO wichtig ????

  18. Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 0 40 Zeit (µs) Pulsweite (W)

  19. Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden... Laser Laser Spannung Spannung Zeit Zeit Spannung Spannung Laser Laser Zeit Zeit Spannung Spannung Laser Laser Zeit Zeit

  20. ... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 0 Zeit (µs) Pulsweite (W) Pulsweite (W) - aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe

  21. Die Einzelzellbetrachtung ist bei Zellzyklusmessungen extrem relevant!!! vs. Faktor 101-104 Faktor 2

  22. Anders gesagt: 2 x G1 macht 1 x G2

  23. DDM = doublet discrimination Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter

  24. Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!! (Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)

  25. Spannung Zeit Jetzt wird‘s richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!! Die THEORIE: • G1: • 1. Signal deutlich niedriger • viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen • etwas kürzere Dauer • G2: • 1. Signal deutlich höher • viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen • etwas längere Dauer Spannung Zeit Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche

  26. Spannung Zeit Weiter gut AUFPASSEN!!!!! Einzellzellen • G2: • 1. Signal deutlich höher • viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen • etwas längere Dauer Spannung FL-3-Fläche Zeit • G1: • 1. Signal deutlich niedriger • viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen • etwas kürzere Dauer FL-3-Weite Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal

  27. Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt hat... FL3-Höhe FL3-Fläche Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe

  28. Einzelzell- diskriminierung Der erwähnte lineare Zusammenhang G1/G0 CV als Gütekriterium G2/M Dazwischen: S-Phase Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper

  29. Auswertung der Daten I • Innerhalb von CellQuestVorteil: einfach und billigNachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt (vgl. Dean PN, J Cell Biol. 1974 Feb;60(2):523-7)

  30. Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit G0/G1 G2/M S Wieder die Einzelzell- diskriminierung

  31. Ein Beispiel für Aneuploidie

  32. Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen • Verwendung anderer Farbstoffe z.B. 7-AAD statt PI (teurer und aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper • Darstellung der S-Phase durch BrdU-Pulsbehandlung

  33. Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen • Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3) • Trennung von Tumor- und Normal-population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)

  34. Weitere Infos und Software-download www.charite.de/maximalmethodisch

  35. Nächstes Thema: Stephanie Krämer, Tierärztin(Nephrologisches Forschungslabor) „Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen“ Bitte haltet euch über die homepage auf dem Laufenden: www.charite.de/maximalmethodisch

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