Mikroskopická technika

1. Mikroskopická technika Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Jana Albrechtová

2. Co vás tu čeká? • Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.) • Speciální světelná a fluorescenční mikroskopie (V. Hampl a kol.) • Elektronová mikroskopie (V. Sacherová a kol.) • Základy obrazové analýzy (J. Albrechtová a kol.)

3. Co potřebujete na zápočet? • Minimálně 75% účast na praktiku • Odevzdání protokolů vypracovaných během cvičení • Nákresy dělejte velké, • Kreslete, co vidíte v mikroskopu a ne, co je v naší prezentaci, • nestínujte, nešrafujte.

4. Doporučené studijní materiály • Naše webové stránky, kde jsou uvedeny prezentace k přednáškám i odkazy na literaturu: http://natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikroskopickatechnika/

5. Něco navíc o světelné mikroskopii Knihy a skripta: • Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 • Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy • Petr Smékal: Experimentální metody biofyziky II, Světelná a elektronová mikroskopie. Skriptum PřF Ostravské Univerzity, 1995 • Časopis Vesmír: • Mikroskopy, věda, průmysl... 1997/10, str. 576 • Mikroskopie (barevná dvojstrana uprostřed časopisu). 2004/3 • Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146 A samozřejmě internet!!!Například stránky firem vyrábějících mikroskopy

6. Světelná mikroskopie

7. Krátký pohled do historie mikroskopování • 1590-1610 otec a syn Janssenové, první mikroskop • 17. -18. století A. Leeuwenhoek • 1847 průmyslová výroba mikroskopů firmou Zeiss • 1911 C. Reichert, fluorescenční mikroskop s UV excit. • 1932 F. Zernick, fázový kontrast • 1955 Nomarski, diferenciální interferenční kontrast • 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop • 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop

8. Leeuwenhoekův mikroskop Krátký pohled do historie mikroskopování http://www.botany.ubc.ca/keeling/resomicr1.html

9. Hookův mikroskop cca 1678 Krátký pohled do historie mikroskopování

10. Světlo Způsoby popisu ve fyzice: Vlnový model (elektromagnetické vlnění) Kvantový model (proud fotonů) Geometrický model (světelný paprsek)

11. Světlo • Rychlost (c) Ve vakuu 3 x 108 m/s • Vlnová délka (l) Vzd. mezi odpovídajícími si body sinusoidy • Amplituda (A) Největší odchylka sinusoidy od nulové hodnoty • Fáze (f) Udává v jaké části sinusoidy se vlnění nachází v urč. časovém úseku • Frekvence (f) Počet kmitů za jednotku času

12. Světlo

13. Ohyb (difrakce) a skládání (interference) světla

14. Ohyb (difrakce) a skládání (interference) světla

15. Ohyb (difrakce) a skládání (interference) světla

16. Odraz a lom světla úhel dopadu = úhel odrazu

17. Odraz a lomsvětla řidší prostředí hustší prostředí = lom ke kolmici

18. Odraz a lomsvětla = lom od kolmice řidší prostředí hustší prostředí

19. Čočka Světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku se v obrazové rovině sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu

20. čočka Ohnisko (F) Optická osa ohnisková rovina rovina čočky ohnisková vzdálenost Čočka

21. Čočka

22. Skutečný a převrácený obraz Okulár, lupa Objektiv F  Zdánlivý obraz předmět mezi F a 2xF Předmět blíže než ohnisko (F) čočky Čočka – vznik obrazu F F f F

23.  Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz zdánlivý a zvětšený obraz skutečný, převrácený a zvětšený obraz Vznik obrazu ve světelném mikroskopu

24.  Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz Vznik obrazu ve světelném mikroskopu

25. Vznik obrazu ve světelném mikroskopu Fyzikální podstata vzniku obrazu v mikroskopu: Ernst Abbe (1873): poměrně složitá teorie, založená na využití Huygensova principu a interferenci transformovaných světelných vln procházejících preparátem

26. Zvětšení světelného mikroskopu Zvětšení objektivu x zvětšení okuláru

27. zvětšení numerická apertura Zvětšení světelného mikroskopu Maximální užitečné zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu

28. numerická apertura Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu Vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body a = 0,61 l/ n x sina l - vlnová délka n – index lomu prostředí před objektivem a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu • Rozlišovací schopnost lze zvýšit: • snížením λ použití modrého světla (modrý filtr) • zvyšováním n   použití imerzního oleje

29. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu vzdálenost dvou bodů, jež jsme schopni vnímat samostatně oko asi 0,25mm U mikroskopu odpovídá polovině vlnové délky použitého záření = cca. 0,2 µm Světelný mikroskop: 1000 x víc než oko

30. zvětšení numerická apertura Zvětšení světelného mikroskopu Maximální užitečné zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu

31. Okuláry Objektivy Stolek Hlavní vypínač Kondenzor Regulace osvětlení Křížový posun Makro a mikrošroub Zdroj světla

32. Preparát č. 2:NAKRESLIT!!!Paramecium caudatum Zvětšení:

33. Typy objektů • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně různé části světelného spektra, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

34. Barvení preparátů Nativní Živé buňky – nutno použít vhodný fyziol. roztok (savci a ptáci 0,85%, obojživelníci 0,64%, pufrovaný fyz. roztok PBS...) možno barvit vitálně karmín – potravní vakuoly mitotracker – mitochondrie metylénová modř – odlišení živých a mrtvých bb, živé se neobarví Trvalé Musí se fixovat – proti posmrtným změnám bb a tkání při zachování barvitelnosti denaturací bílkovin se zpevní a zakonzervují bb struktury • Roztěry • Suchý r. –fixace po zaschnutí (methanol), 2D objekty • Vlhký r. – fixace za vlhka (Bouin-Holland, sublimát, aj.), 3D objekty • Celkové preparáty • Kus tkáně • Malý živočich (fix. Alkohol 70-80% či formaldehyd 4% Typy barviv: pH kyselá: eosin, světlá zeleň, kyselý fuchsin, kyselina pikrová zásaditá:metylénová modř, toluidinová modř, bazický fuchsin neutrální: Giemsa-Romanowski, různé formy stříbra objekt barvení motolice a tasemnice:borax-karmín prvoci: Giemsa-Romanowski, protargol, hematoxylin tkáně: hematoxylin-eosin

35. Nativní preparát:Tetrahymena pyriformiskarmín Trvalé preparáty: Tetrahymena pyriformisopálová modř Trypanosoma carassiGiemsa-Romanowski Tritrichomonas foetusGiemsa-Romanowski

36. Trvalé barvení:Suchý roztěrTrypanosoma carassiTritrichomonas foetuspro barveníGiemsa-Romanowski cca 45°

37. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

38. Preparát č. 3:Trypanosoma sp.

39. Preparát č. 4:Tritrichomonas foetus

40. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

41. Preparát č. 5: Tetrahymena pyriformis Barvení: karmín

42. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

43. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski:Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

44. Imerzní olej

45. Imerzní olej • Předejdeme ztrátám světla • Do objektivu dopadne větší množství paprsků • Obraz obsahuje víc detailů

46. Imerzní olej

47. Preparát č. 6:NAKRESLIT!!!Tetrahymena pyriformis Barvení: opálová modř Zvětšení: cytostom řasinkové rýhy vakuola

48. Preparát č. 7: NAKRESLIT!!!Trypanosoma carassi Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: jádro kinetoplast undulující membrána

49. přední bičíky pelta jádro axostyl undulující membrána kosta volný zadní bičík Preparát č. 8:NAKRESLIT!!!Tritrichomonas foetus Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: