V äzbová analýza a mapovanie génov

1. Väzbová analýza amapovanie génov

2. Identifikácia génov • Funkčné klonovanie - identifikácia génu na základe znalosti proteínu napr. F-VIII -hemofília A; PAH gén - fenylketonúria - získanie časti génu sekvenovaním proteínu - nevýhody: nutnosť poznania proteínu purifikácia proteínu, protilátky, cDNA knižnice degenerovanosť genetického kódu • Pozičné klonovanie - identifikácia neznámeho génu určením jeho lokalizácie, bez potreby poznania funkcie proteínu - nevýhody: analýza DNA viacerých jedincov analýza väčších resp. viacerých rodokmeňov lokusová heterogenita

3. História mapovania génov • Lokalizácia daltonizmu, hemofílie, DMD na X chromozóm na základe dedičnosti • Metóda chromozómových markerov – lokalizácia Amy2B génu na 1q „uncoiler“ chromozóm • Metóda štúdia efektu dávky: trizómie: 150%, chromozómové delécie 50% dávky • Chromozómová lokalizácia: - Metóda medzidruhovej hybridizácie somatických buniek • Subchromozomálna lokalizácia: - Hybridizácia buniek s čiastočne deletovanými chromozómami - chromosome-mediated gene transfer - Radiačné hybridy a parciálne štiepenie restrikčnými endonukleázami - FISH

4. Hybridizácia somatických buniek Hybridizácia ľudských a myších buniek Vznik nestabilného hybridu, u ktorého v následných mitózach dochádza k strate väčšiny ľudských chromozómov Možnosť vytvoriť súbor (panel) viac-menej stabilných hybridných línií obsahujúcich každý ľudský chromozóm Monochromozomálne hybridné línie možno vytvoriť aj priamo fúziou mikrobuniek (micocell – vznik po pôsobení colcemidu)

5. Fúzia buniek s chromozomálnymi deléciami

6. Zostavenie kontigov pokrývajúcich celý chromozóm

7. Fluorescence in situ hybridization(FISH)

8. Chromosome painting

9. Genetické markery • U modelových organizmov mapovanie dvoch fenotypových znakov ≠ u človeka • Potreba nových DNA markerov pre mapovanie génov u človeka. 1900 krvné skupiny cca 20 1960 sérové proteíny a izoenzýmy 102 1980 DNA RFLP 103 1985 VNTR - minisatelity 104 1990 - mikrosatelity (STR) 105 1995 SNP (single nt polymorphisms) 106

10. Informatívnosť polymorfizmov 1. početnosť a lokalizácia na genóme - krvné a sérové skupiny – malý počet - VNTR prevažne v telomerických oblastiach - STR rozptýlené po chromozómoch 2. informatívnosť polymorfizmov - RFLP/SNP polymorfizmy majú len 2 alely k heterozygozita H = 1 – Σ xi2 i=1 (preto takmer ideálne sú STR polymorfizmy s vysokým počtom rovnomerne zastúpených aliel)

11. V súčasnosti využívané polymorfizmy • STR polymorfizmy - rozptýlené po celom genóme, - väčší počet aliel =› vysoká informatívnosť, - na pokrytie genómu postačuje 400 STR (~ 10cM) - nevýhodou je absencia „high-throughput“ metódy • SNP polymorfizmy - takmer vždy len dve alely =› nižšia informatívnosť - vyvážené je to ich obrovským počtom (›106) - „high-throughput“ čipová analýza (až 100 tisíc SNP v jednej analýze)

12. Meiotický crossing-over

13. Väzba génov (lokusov) • - voľná kombinovateľnosť – lokusy na rôznych chromozómoch • - synténia – lokalizácia lokusov na jednom chromozóme • vzhľadom k dĺžke chromozómov sa vzdialené lokusy javia • ako pri voľnej kombinovateľnosti • väzba lokusov – medzi blízko ležiacimi lokusmi • pravdepodobnosť rekombinácie zavisí od vzájomnej vzdialenosti

14. Porovnanie fyzickej a genetickej vzdialenosti Rekombinačná frekvencia – θ - je % pravdepodobnosť meiotickej rekombinácie medzi dvomi lokusmi θ = 0 úplná väzba θ = 0,5 voľná kombinovateľnosť Závisí od: Oblasti na chromozóme ter>cen pohlavia ženy > muži Mapová vzdialenosť cM – centimorgan 1cM = 1% rekombinácie (θ= 0,01) 1cM ~ 1Mb

15. Viacnásobný cross-over Vzdialenosť M1 – D = θ1 Vzdialenosť D- M2 = θ2 Ale vzdialenosť M1 – M2 ≠ θ1 + θ2 V skutočnosti je θM1-M2 <θ1 + θ2 V dôsledku dvojitých crossoverov preto θM1-M2 = θ1 + θ2 platí len pre malé vzdialenosti

16. Identifikácia rekombinantov v rodokmeňovej analýze Je potrebné poznať fázu Analýza trojgeneračných rodokmeňov

17. Mapovanie génu do oblasti na chromozóme

18. Linkage mapping Metóda LOD score: Testovanie pravdepodobnosti, že dva sledované lokusy sú vo väzbe k pravdepodobnosti ich voľnej kombinovateľnosti - Väzba pri rekombinačnej frekvencii θ - Voľná kombinovateľnosť θ = 0,5 (1- θ)N . θR Z(θ) = log 10 -------------- 0,5 N+R väzba dokázaná, ak Z>3 (log10 1000= 3) väzba vylúčená , ak Z<-2 (log10 1/100= -2)

19. Autozygosity mapping

20. Autozygosity mapping

21. Autozygosity mapping Genotypy príbuzných postihnutých v dvoch STR polymorfizmoch a) polymorfizmus vzdialený od génu zodpovedného za ochorenie b) polymorfizmus ležiaci v blízkosti hľadaného génu

22. Využitie väzbovej analýzy • Lokalizácia a identifikácia génov zodpovedných za dedičné ochorenia, • Využitie v nepriamej DNA diagnostike ochorení, • Identifikácia lokusovej heterogenity niektorých ochorení, • zostrojenie genetickej mapy celého genómu - triangulácia genómu potrebná pre úplné sekvenovanie genómu

23. Informatívne meiózypri nepriamej diagnostike • AD dedičnosť • Lokus – ochorenie (gén) • Lokus – DNA polymorfizmus s alelami A1, A2, A3, A4 • Rodokmene A, B neinformatívne • Rodokmene C, D • informatívne