1 / 3

„AFLP, amplified fragment length polymorphism “

„AFLP, amplified fragment length polymorphism “. Alternativ a k RAPD na bázi DN A fingerprintingu nabízí metoda AFLP ( česky polymorfismus délek amplifikovaných fragment ů ) (Vos et al. 1995)

onaona
Download Presentation

„AFLP, amplified fragment length polymorphism “

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. „AFLP, amplifiedfragment length polymorphism“ • Alternativa k RAPD na bázi DNA fingerprintingu nabízí metoda AFLP (česky polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů) (Vos et al. 1995) • Multilokusová analýza AFLP má mnohem vyšší schopnostrozlišení polymorfismu alel než metoda RFLP (Barker et al. 1999) a je velmi vhodnou technikou pro studium genetickévariability na úrovni druhůči populací u široké škálu organismů (např. Liu et al. 1998, Wang et al. 2004, Uthicke et Conand2005) • možnost rychle vygenerovat velké množství polymorfních markerů i u druhů, o nichž nemáme jedinou předchozí genetickou informaci • Princip metody: technika AFLP kombinuje výhody osvědčeného principuPCR (polymerase chain reaction) a štěpení restrikční endonukleázou pro získání specifických selektovaných restrikčních fragmentů celkovéDNA jakéhokoli jedince, tedy napříč genomem, za vysoké míryopakovatelnosti pokusu. • „nevýhody“: dominantní marker s občas nejistým původem a homologií fragmentů, finančně dražší metoda, komplikovanější protokol

  2. „AFLP, amplifiedfragment length polymorphism“ Využití • vhodnost AFLP markerů při studiu hybridizace, introgrese, definice klonů, polyploidů, stanovení genotypu (vyšší variabilita oproti konzervativním alozymovým lokusům) • určování paternity díky variabilitě a vysoké míře reprodukovatelnosti výsledků • systematika, fylogeneze, fylogeografie • populačně-genetické studie: vnitro- a mezipopulační variabilita, kvantifikace genového toku, podobnost/rozdílnost mezi populacemi • AFLP protokol na: http://www.natur.cuni.cz/~muncling/praktGM.htm (Projekt FRVŠ 813/2008)

  3. AFLP, princip metody 1. restrikce: specifické rozštěpení celkové DNA dvěma restrikčními endonukleázami: MseI - rozpoznává 4bp dlouhou sekvenci (TTAA) a EcoRI rozpoznává 6bp (GAATTC) velké množství fragmentů, mají na jednom konci MseI a na druhém EcoRI štěpné místo 2. ligace:T4 ligázou jsou k fragmentům připojeny specifické adaptory, tím známe sekvence začátků a konců všech fragmentů 3. preselektivní amplifikace: redukce vysokého počtu fragmentů, PCR s primery komplementární adaptorům, avšak o 1 bázi delší a přesahují tak "dovnitř" studovaného fragmentu, namnoží se tak pouze 1/4 všech fragmentů (pouze ty s komplementární bázi), tj. se 2 primery je amplifikována pouze 1/16 fragmentů (1/4 x 1/4) 4. selektivní amplifikace: další redukce s primery se třemi selektivními nukleotidy (přesahy "dovnitř" studovaných fragmenty, amplifikována je pouze 1/256 všech fragmentů (1/16 x 1/16) převedení na 0-1 matici (presence/absence fragmentu), výpočet párových koeficientů genetické vzdálenosti (Nei, Jaccard...), konstrukce stromu pomocíUPGMA, neigbour-joining..... 5. visualizace a vyhodnocení: s flourescenčně značeným EcoRI primerem můžeme k vyhodnocení fragmentů využít automatický sekvenátor

More Related