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KIR 与移植、疾病的关联研究

KIR 与移植、疾病的关联研究. 邓志辉 深 圳 市 血 液 中 心 深圳市免疫遗传与组织配型医学重点实验室 二 0 一三年八月. HLA polymorphism: allelic diversification KIR polymorphism: allelic + chromosomal. MICA. HLA-A. HLA-B. HLA-C. MICB. MHC. 6p21.3. HLA-E. HLA-J. HLA-G. HLA-F. HLA-H. NKp46.

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  1. KIR与移植、疾病的关联研究 邓志辉 深 圳 市 血 液 中 心 深圳市免疫遗传与组织配型医学重点实验室 二0一三年八月

  2. HLA polymorphism: allelic diversification KIR polymorphism: allelic + chromosomal MICA HLA-A HLA-B HLA-C MICB MHC 6p21.3 HLA-E HLA-J HLA-G HLA-F HLA-H NKp46 ILT GPVI FCaR LAIR KIR ILT LRC 19q13.4 Haplotype A 2DL4 3DL1 2DS4 3DL2 3DL3 2DL3 2DP1 2DL1 3DP1 Haplotype B 3DL3 2DS2 2DL2 3DP1 2DL4 3DS1 2DL5 2DS5 2DS1 3DL2 Inhibitory (L) Activating (S) pseudogene

  3. 内容简介 • KIR分子的结构、功能，KIR基因结构、命名、多态性 • KIR基因的分子生物学检测方法 PCR-SSP, Flow-rSSO, Quantitative PCR, PCR-SBT • KIR与骨髓及器官移植 • KIR与疾病的关联研究（病毒感染性疾病，白血病）

  4. KIR分子 • 天然杀伤细胞( natural killer cell，NK)是机体固有免疫系统的重要组成部分，近年来NK细胞的免疫调节作用受到人们的广泛关注。 • 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)属免疫球蛋白超家族成员，主要表达于自然杀伤细胞和部分活化T细胞表面。

  5. KIR分子结构及分类 • 结构 • 胞外区、跨膜区及胞内区。 • 分类 1、胞外结构域的数量 KIR2D/KIR3D 2、胞浆尾的长短 L型/S型 3、功能效应 抑制型/激活型

  6. KIR分子的功能 Protection iKIR HLA Normal Cell NK Cell ligand Act. rec. Dominant inhibition Missing-self recognition No Lysis iKIR HIV+ Targets NK Cell Act. rec. ligand Cytokines Lysis • KIR分子与HLAⅠ类配体结合，共同调节NK细胞的活性。 • KIR在移植免疫、生殖免疫、肿瘤免疫、机体抗感染中发挥着重要作用。

  7. HLA-C分子1区的第80位氨基酸残基与KIR分子特异性识别方式的不同：HLA-C分子1区的第80位氨基酸残基与KIR分子特异性识别方式的不同： C1组（C*01, 03, 07, 08, 12, 14） 等位基因的α重链上第80位氨基酸残基为天冬氨酸，特异性识别KIR分子中KIR2DL2、2DS2和2DL3。 C2组（C*02, 04, 05, 06, 15, 16, 17, 18）等位基因的α重链上第80位氨基酸残基为赖氨酸。特异性识别KIR分子中KIR 2DL1和 2DS1。 KIR分子的配体

  8. KIR分子的配体 HLA-B Bw4 (40%) Bw6 (60%) 80I 80T Not a ligand for KIR (good control group for studying effects of KIR3DL1 subtypes) KIR3DL1 ligands KIR3DS1 ligands?

  9. KIR分子的配体 HLA-C1 HLA-Bw4 80D Cw1 Cw3 Cw7 Cw8 Cw12 Cw13 Cw14 HLA-C2 Bw4-80T Bw4-80I 80K Cw2 Cw4 Cw5 Cw6 Cw15 Cw17 B*51 B*52 B*53 B*57 B*58 A*24 B*13 B*27 B*37 B*44 HLA-A3, A11 HLA-G KIR2DL2/2DL3 KIR2DS2 KIR2DL1 KIR2DS1 KIR3DL1 KIR2DL4 KIR3DS1 KIR3DL2

  10. NK 细胞的受体 inhibitory activating Receptor Structure type Ligand Receptor Structure type Ligand KIR2DL Ig HLA-C KIR2DS Ig HLA-C KIR3DL Ig HLA-B,C KIR3DS Ig HLA-B? LILRB1,2 Ig HLA-G LILRA3 Ig ? CD94:NKG2A Lectin HLA-E CD94:NKG2C/E Lectin HLA-E LAIR-1 Ig ? LAIR-2 Ig ? NKG2D Lectin MIC-A,B NKp30 Ig ? NKp44 Ig ? NKp46 Ig ? CD16 Ig Fc

  11. KIR-HLA受配体 • KIR配体： 阐明：2DL1~2DL4, 3DL1,3DL2; 2DS1, 2DS2 可能：3DS1 未知：2DS3，2DL5…. • KIR重复次数存在个体差异 • NK细胞上除了KIR分子，还存在其它受体（NKG2A /2C） NK细胞受-配体的复杂性，仅根据单个KIR分子配体的缺失，难以预测NK细胞激活。从KIR+HLA配体基因组合型，开展移植/疾病关联的研究十分必要。

  12. KIR基因家族 KIR基因家族：14个功能性框架基因、2个假基因。 NKp46 ILT GPVI FCaR LAIR KIR ILT LRC 19q13.4 Haplotype A 2DL4 3DL1 2DS4 3DL2 3DL3 2DL3 2DP1 2DL1 3DP1 Haplotype B 3DL3 2DS2 2DL2 3DP1 2DL4 3DS1 2DL5 2DS5 2DS1 3DL2 Inhibitory (L) Activating (S) pseudogene

  13. IPD-KIR database( http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/ )

  14. KIR等位基因的命名方式 KIR框架基因名称后紧接着“*”号，“*”号之后的前3位数表示等位基因，即编码区的非同义突变；第4、5位数表示编码区的同义突变，第6、7位数表示非编码区的碱基取代。 KIR3DL1/3DS1：同一基因座，不同的lineage，等位基因不重叠命名，如有3DL1*002，则没有3DS1*002。

  15. KIR2DL2/2DL3

  16. KIR新等位基因的序列提交 • accession number GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.htmlEMBL: http://www.ebi.ac.uk/Submissions/index.html DDBJ: http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub-e.html • KIR Nomenclature Committeehttp://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/submit_guide.html • Full length sequences are preferable though not essential.

  17. 2DL1*020（GQ421728），Hou L., Hurley C.K., Jiang B.; tggtcgtcag catggcgtgt gttgnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 • nnnnggttct tcttgctgca gggggcctgg ccacatgagg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gagtccacag aaaaccttcc ctcctggccc acccaggtcg 300 • cctggtgaaa tcagaagaga cagtcatcct gcagtgttgg tcagatgtca tgtttgaaca 360 • cttccttctg cacagagagg ggatgtttaa cgacactttg cgcctcattg gagaacacca 420 • tgatggggtc tccaaggcca acttctccat cggtcgcatg acgcaagacc tggcagggac 480 • ctacagatgc tacggttctg ttactcactc cccctatcag gtgtcagctc ccagtgaccc 540 • tctggacatc gtgatcatag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 600 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 660 • gtctatatga gaaaccttct ctctcagccc agctgggccc cacggttctg gcaggagaga 720 • atgtgacctt gtcctgcagc tcccggagct cctatgacat gtaccatcta tccagggaag 780 • gggaggccca tgaacgtagg ctccctgcag ggcccaaggt caacggaaca ttccaggctg 840 • actttcctct gggccctgcc acccacggag ggacctacag atgcttcggc tctttccatg 900 • actctccata cgagtggtca aagtcaagtg acccactgct tgtttctgtc acagnnnnnn 960 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngaaacc cttcaaatag ttggccttca 1080 • cccactgaac caagctccaa aaccgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1140 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1200 • nnnnngtaac ccccgacacc tgcacattct gattgggacc tcagtggtca tcatcctctt 1260 • catcctcctc ttctttctcc ttcatcgctg gtgctccaac aaaaaaannn nnnnnnnnnn 1320 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1380 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnatg ctgcggtaat ggaccaagag tctgcaggaa 1440 • acagaacagc gaatagcgag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1500 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1560 • gactctgatg aacaagaccc tcaggaggtg acatacacac agttgaatca ctgcgttttc 1620 • acacagagaa aaatcactcg cccttctcag aggcccaaga cacccccaac agatatcatc 1680 • gtgtacacgg aacttccaaa tgctgagtcc agatccaaag ttgtctcctg cccatga 1737

  18. Linker Leader D0 D1 D2 TM Cyt. KIR2D KIR3D KIR2DL4/5 KIR3DL3 KIR3DP1a KIR3DP1b 16 Kb 1 KIR基因结构 功能性KIR基因组全长序序在10-16 kb, HLAⅠ类等位基因全长序列3.3 kb, 具有5’-promotor ~ 3’-UTR区的KIR等位基因总数为304个。

  19. Linkage Disequilibrium Analysis of KIR Genes in CEPH ( National Cancer Institute，Maureen P Martin, Lewontin’ Standardised measure, D’)

  20. LD 3DS1-2DS1 • LD 2DS4-3DL1 • LD 2DL1-2DP1 • LD 2DL2-2DS2 • LD 2DL5-2DS3/2DS5

  21. KIR基因的多态性 • 等位基因水平 • 单倍体组成 • NK细胞表达水平 • 不同人群之间的差异

  22. IPD-KIR 数据库公布的KIR等位基因，Release 2.4.0 除两个假基因外，包括14种功能性的KIR框架基因，每一框架基因具有14~107个不同的等位基因。

  23. Historic Unequal Crossover within the KIR Gene Cluster 3DL3-2DS2-2DL2-2DL5B-2DS3-2DP1-2DL1*004-3DP1-2DL4-3DS1-2DL5A-2DS3-2DS1-3DL2 (f = 0.035) X 3DL3-2DS2-2DL2-3DP1-2DL4-3DL1-2DS4-3DL2 (f = 0.14) 3DL3-2DS2-2DL2-2DL5B-2DS3-2DP1-2DL1*004-3DP1-2DL4-3DS1-2DL5A/3DP1-2DL4-3DL1-2DS4-3DL2 + 3DL3-2DL3-2DP1-2DL1-3DP1/2DL5A-2DS3-2DS1-3DL2

  24. KIR单倍体组成的差异 3DL1 3DS1 2DL2 2DL3 2DS3 2DS5 3DL3 2DS2 2DL5B 2DP1 2DL1 3DP12DL4 2DL5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4 3DL2 L1 L1 L1 L1 S1 S1 S1 L1 S1 S1 L1 S1 L1 L1 L1 L1 L1 S1 S1 S1 L1 L1 L1 S1 L1 L1 L1 L1 L1 L1 L1 L1 S1 S1 3 3 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 3 2 3 3 2 2 2 2 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 3 3 5 5 3 3 3 3 3 3 3 ? ? ? ? ? ? ? ? pseudogene activating (S) inhibitory (L)

  25. KIR genes are expressed on some but not all NK cell clones within a given individual NK NK NK NK NK NK Valiente et al. Immunity, 1997 Li et al. PLoS Genetics, 2008 KIR2DL1 KIR2DL2 KIR2DL3 KIR2DL4 KIR3DL1 KIR3DL2 KIR2DS2 KIR2DS4 The more copies of a given KIR gene present in a given person, the greater the number of NK cells that express that gene

  26. 不同人群之间的差异 • KIR3DL1*01501仅在非洲人群中出检出，在其他人群中尚未见报道(Artavanis, et al. J Immunol)。 • KIR3DL1*01502为日本和南方汉族人群中检出频率最高，均大于70%；高加索、非洲人群中的频率＜25%。 • KIR3DL1*001、*002、*004和*005是高加索人群中检出频率最高的四种等位基因，均大于15%(Middleton, et al. Immunogenetics)，但其中的KIR3DL1*002和*004在南方汉族、日本人群中均未检出。 • KIR3DL1*004、*01501、*01701和*031在非洲人群中检出率均大于10% (Jiang, Tissue Antigens)，但在中国南方汉族人群和日本人群中均未检出。

  27. 南方汉族KIR-HLAⅠ类复合物多态性 • KIR框架基因频率、单倍体组合型频率等数据和论文，以往研究者作了大量的报道。 • KIR发挥作用，依赖于相应的配体存在。 • KIR与移植、疾病关联研究中，不仅仅是 KIR基因多态性， HLAⅠ配体 单个KIR+HLA “KIR—HLAⅠ类配体复合物”基因组合型 • 从四个方面调查南方汉族无关人群KIR—HLAⅠ类复合物多态性

  28. Observed frequencies of KIR frame genes in southern Chinese Han population (n=503)

  29. Frequencies of HLA ligands in southern Chinese Han population (n=503)

  30. Frequencies of matched KIR+HLA pairs in southern Hans

  31. KIR-HLA compound gene profiles in southern Han（A total of 193 compound KIR-HLA ligand profile in 480 individuals was identified）

  32. 二、KIR基因的分子生物学检测方法 1、 KIR框架基因有无的检测 KIR PCR-SSP, Flow rSSO，etc. 2、 KIR框架基因的测序

  33. 1、KIR框架基因有无的检测 • KIR PCR-SSP • 商品化试剂盒：Invitrogen, Inno-train, etc

  34. 1、KIR框架基因有无的检测 • NCI方法：设计并采用两对KIR 框架基因特异性异物检测同一个KIR框架基因，防止漏检和丢失。 • PCR扩增：单个扩增、复合扩增（Multiplex PCR） • PCR产物的检测：琼脂糖电泳，毛细管电泳自动检测

  35. KIR2DS4 subtyping using Labchip GX machine

  36. Detection of PCR product using melting curve analysis (Sybr-Green，ABI 7900 )

  37. 高通量Flow-rSSO (Lot#004, n=77, 2例与已知的KIR SSP结果不一致，rSSO显示KIR2DL2 存在) KIR框架基因有无的检测

  38. KIR框架基因有无的检测 初检采用商品化KIR SSP检测KIR2DL2结果为阴性， 复检采用NCI的方法结果仍为阴性。

  39. KIR框架基因有无的检测 • 调节第20号磁珠荧光校准 cut-off值 , 更新后的Lot#005 rSSO的结果为阴性，与KIR SSP结果相一致。 KIR的应用研究中，重视质量控制和平行对照。

  40. KIR框架基因的测序 1、不同的KIR框架基因，其表达水平不同： McErlean等研究发现，不同的KIR框架基因mRNA表达水平由高到低依次为：KIR3DL2>KIR2DS2>KIR3DS1> KIR2DS5 >KIR2DL5>KIR2DS3>KIR2DL1 >KIR3DL1 > KIR2DS1>KIR2DL2>KIR2DL4> KIR2DS4 >KIR2DL3。 2、同一框架基因中的不同等位基因，其表达水平、介导的抑制性/激活性强弱也存在差异。 McErlean等报道KIR3DL1 mRNA表达水平由高到低依次为： KIR3DL1*007>*004>*00101>*002> *005>*01502>*008 Yawata等研究发现KIR3DL1各等位基因： 在细胞膜上表达水平由高到低依次为：KIR3DL1*01502>*020>*001>*007>*005 介导的抑制性作用由强到弱依次为：KIR3DL1*001> *005>*01502>*020>*007 从等位基因水平开展KIR多态性的应用研究十分必要。

  41. KIR框架基因的测序 • 当前尚无商品化KIR测序分型试剂， • 也没有配套的KIR分析软件。 当前大多采用 PCR-SSP和Flow-rSSO方法检测受检者KIR框架基因的有、无，目前尚达不到等位基因水平。

  42. KIR框架基因测序的策略

  43. KIR3DL1 bp 34 36 300 51 102 53 285 294 177 5’pro 3’-UTR E4 E3 E1 E2 E5 E6 E7 E8 E9 stem cytoplasmic D2 leader D0 D1 transmenbrance 14kb

  44. 南方汉族 SSP法KIR框架基因的检测结果 288个随机个体，KIR3DL1框架基因阳性个体279个，阳性率为96.88%， 图1 PCR-SSP法KIR框架基因的扩增效果

  45. DNA序列比对软件:Clustal

  46. PCR-SBT的PCR产物特异性扩增效果 KIR3DL1各外显子PCR 产物电泳图 图中第1、2、3、4、5、6孔为KIR3DL1阳性标本，第7孔为KIR3DL1阴性标本。M： TaKaRa DL2000 marker

  47. KIR3DL1框架基因PCR-SBT测序 PCR产物的纯化 采用OMEGA公司的磁珠试剂纯化PCR产物。10 μL扩增产物中加入18 μL磁珠悬浮液，混匀后，室温下孵育5min，而后放到磁力架上，采用全自动工作站进行操作。

  48. 表3 南方汉族人群KIR3DL1等位基因检出频率及其与其它人群的比较

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