Hematológiai és hemosztazeológiai vizsgálatok preanalitikai vonatkozásai

1. Hematológiai és hemosztazeológiai vizsgálatok preanalitikai vonatkozásai Barabás Eszter SE-LMI, Központi Laboratórium (Pest) 2013.05.30

2. A laboratóriumi tevékenység három szakaszra bontható: • Preanalitikai szakasz - laboratóriumon kívüli - laboratóriumon belüli • Analitikai szakasz • Posztanalitikai szakasz

3. Preanalitikai folyamatok Laboratóriumon kívül • vizsgálat kiválasztása, kérése • beteg előkészítése, azonosítása • mintavétel • mintaszállítás Laboratóriumon belül • minta átvétele és azonosítása • minta előkészítése • minta minőségének ellenőrzése • minta tárolása

4. Beteg azonosítása • Legalább két azonosító • Beteg jelenlétében címkézzék fel a csövet • Egyszerre csak egy beteggel foglalkozzanak Betegtévesztés okai és gyakorisága

5. In vivo eltéréseket okozó tényezők • nem • kor • testsúly • cirkadián bioritmus • étkezés • gyógyszerek • betegségek, műtétek • etnikai és földrajzi tényezők • terhesség • stressz

6. Biológiai variabilitás • Egy faj egyedei egymástól bizonyos tulajdonságokban, genetikai és környezeti okokból kifolyólag különböznek - egyedek közti variabilitás Inter-individual - egyedi variabilitás Intra-individual

7. Egyedek közötti (interindividuális) variabilitás Egyes laborparaméterek különböző egyének közti eltérő koncentrációja. rassz életkor nem terhesség testsúly

8. Egyeden belüli (intraindividuális) variabilitás Egy egyénben, egy adott paraméter koncentrációjának az ingadozása a kiindulási ponthoz képest. • Napszaki ingadozás • Havi • Szezonális • Életkorral összefüggő (PC) • Diéta, betegség, gyógyszeres kezelés, stressz hatás

9. A beteg előkészítése • 12 órás táplálékmegvonás (bizonyos vizsgálatokhoz étrendi előírások betartása pl. glükóz terhelés, zsíranyagcsere vizsgálat) • DE bő folyadékfogyasztás (víz, cukor nélküli tea! ) • élvezeti szerek kerülése (dohányzás!) • gyógyszerek • fizikai aktivitás

10. Étkezés, stimulánsok A véralvadás folyamatait a szélsőségektől mentes, kiegyensúlyozott étrend nem befolyásolja. Így a vérvételnek nem szükséges éhgyomorra történnie, könnyű (alacsony zsírtartalmú) reggeli elfogyasztható előtte. • Haldiéta(makréla) csökkenti a vérlemezke számot és alacsonyabb fibrinogén-szintet mérhetünk a következő pár hétben. A trombocitákaggregációja csökken a halolajban levő többszörösen telítetlen zsírsavak miatt. • Nagy mennyiségű C, E-vitamin, gyömbér, hagymafogyasztása zavarja a trombocitaaggregációt. • Krónikus alkoholizmuscsökkent trombocita számhoz és aggregációhoz vezet. • Dohányzás: fokozza a trombocitaaggregációt és adhéziót, növeli a fibrinogén szintjét.

11. Gyógyszerek Befolyásolhatják a véralvadást terápiásan, illetve mellékhatásokon keresztül. Utóbbira néhány példa: • NSAID: az acetilszalicilsav irreverzibilisen gátolja a COX enzimet, ezzel csökkenti/megszünteti a trombocitaaggregációt. • Orális fogamzásgátlók: hatásukra a legtöbb alvadási faktor aktivitása nő, fokozódik a trombocitaaggregáció, míg az AT és PS szintje csökken. • Széles spektrumú antibiotikumokK-vitamin-hiányt okozhatnak a bélflóra károsítása által.

12. Egy könnyű étkezés hatása a vérsejt paraméterekre Giuseppe Lippi Influence of a light meal on routine haematological tests. Blood Transfus. 2010

13. Mintavétel - Testhelyzet • Függőleges pozícióban hemokoncentráció( a vérsejtek és a fehérjék koncentrálódnak, mert a folyadék átjut az erekből a környező szövetekben) • Fekvő pozícióban hemodílúció Egészséges egyénekben a mért értékek akár 10-20%-kal alacsonyabbak fekvő helyzetben, mint függőlegesben, ödémásokban ez az arány még nagyobb lehet. Annak érdekében, hogy összehasonlítható eredményeket kapjunk, a vérmintákat adott betegtől mindig ugyanabban a testhelyzetben vegyük le.

14. Érték emelkedése, ha a fekvő beteg feláll

15. Mintavétel – Vérvételi technika • Vérvétel helye:valamelyik perifériás véna, többnyire a venacubitalis.

16. Mintavétel – Vérvételi technika • Kompresszió ne tartson tovább 1 percnél, és csak az éppen szükséges erejű legyen. • Tűméret A túl sokáig/túl nagy erővel történő véna okklúzió a fibrinolízis lokális aktivációjához, megnövekedett faktor koncentrációkhoz/ -aktivitáshoz vezet.

17. Mintavétel – Vérvételi technika • A vér zavartalanul, örvénylést okozó megtörés nélkül és rövid idő alatt jusson a csőbe. - Túl gyors áramlás esetén a trombociták/vörösvértestek károsodhatnak, hemolízis jöhet létre - Túl lassú áramlás esetén pedig a vérminta alvadása beindul, akár látható formában alvadékképződéssel, akár láthatatlanul, az alvadási faktorok aktivációjával. • Vérvétel ne kanülből történjen ! Ilyen esetben a mintavétel a másik kar vénájából történjen, vagy a kanül fiziológiás sóval történő átmosását és az első 10-15 ml vér leengedését követően.

18. Mintavétel – Vérvételi eszközök

19. Correct order is: E, D, A, B, C, F (53% correct answers) This order is based on CLSI guideline H3-A6 (2007).The important items are:1. Prevent bacterial contamination from unsterilized tubes (blood culture tubes first)2. Cloth activator in gele tubes can affect to TT and APTT (citrate tube before gele tubes)3. Prevent anticoagulant contamination (heparin-EDTA-fluoride) http://medlab-eqas.blogspot.hu/2011/01

20. Mintavétel – Vérvételi eszközök Vérvétel helyes sorrendje: • Hemokultúra • Citrátos minta • Natív cső • Heparinos minta • EDTA-s minta • Egyéb Abban az esetben, ha csak alvadási tesztek végzésére van szükség, a citrátos minta előtt EDTA-s vér vétele történjen, ugyanis a szúrás után nyert első mintában levő szöveti tromboplasztin téves eredményeket okozhat. Bármely (indokolatlanul) kóros eredmény esetén, új mintavétel javasolt és a vizsgálatot meg kell ismételni.

21. Mintavétel Hematológiai kórképek diagnosztikájára K2-EDTA alvadás gátlót tartalmazó lila dugós csőbe, szakszerűen levett vénás vérminta szükséges. A hemosztázis diagnosztikájában általában plazmát használunk. Ez alól kivételt képez: - antifoszfolipid antitestek vizsgálata (szérum) - heparin indukálta thrombocytopenia szűrőtesztje (szérum) - genetikai vizsgálatok, PFA-100 (teljes vér)

22. Mintavétel Figyelni kell a helyes citrát:vér arányra (1:9). Ha a vérmennyiség kevesebb a kelleténél, a plazma magas citrátkoncentrációjamegnyúlt alvadási időket (főként APTI) okoz, a nagymértékű kalciummegkötés miatt. A jelenleg használatos vákuumos csövekben a vákuum biztosítja a megfelelő citrát:vér arány elérését. Afenti aránytól kb. 10%-os eltérés még elfogadható. Az alvadásgátlót tartalmazó csöveket, a levételt követően, azonnal többször, finoman össze kell forgatni ( átbillenteni 180 ⁰ , legalább 4x), de sohasem rázni.

23. Mintaszállítás • Álló helyzetű, lezárt csövekben történjen • Kerülendő a minták rázatása (hemolízis, alvadás aktiváció) • Centrifugálatlan minták szállítása 15-20 ⁰C-on történjen • Sínekkel ellátott szállítóegység • Pneumatikus cső

24. A minták laboratóriumon belüli kezelése - minta átvétele és azonosítása - minta előkészítése - minta minőségének ellenőrzése - minta tárolása

25. Minta előkészítése, kezelése Minden emberi vérmintát potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni és úgy is kell kezelni!

26. Minta előkészítése, kezelése • Meg kell várni a teljes alvadást natív cső esetén (30 perc) • Centrifugálás időtartamanatív cső esetén 10 perc, 1800g • Plazma szeparálás esetén 2-3000 g, 10-15 perc • Túl hamar történő centrifugálás: fibrinszál kiválás, hemolizált minta

27. Minta előkészítése – hemosztázis vizsgálatokhoz A véralvadás vizsgálatára használt mintavételi csövek antikoagulánsként3,2%-os Na-citrát oldatot tartalmaznak. A citrátos vérmintából centrifugálás által jutunk citrátos plazmához. • Trombocitadús plazma (PRP) (Plt>10 G/l): 37 oC-on 800 rpm, 5 perc centrifugálással nyerjük, trombocitafunkciós mérésekhez használjuk. • Trombocitaszegény plazma (PPP) (Plt<10 G/l): szobahőmérsékleten 3000 rpm, 10-15 perc centrifugálással kapjuk, a rutin hemosztázis-vizsgálatokhoz ezt használjuk. • Trombocitamentes plazma (PFP): 4000 rpm, 20-30 perc centrifugálással nyerjük, és a PPP-hez hasonlóan használhatjuk. Különösen alkalmas olyan tesztekhez, ahol a vérlemezkék zavarhatják a meghatározást (trombocita faktorok, heparin monitorozás, LA, egyéb antifoszfolipid antitestek, fibrinolízis elemei). Felhasználásig fagyasztva tárolandó.

28. Minta minőségének ellenőrzése Minden mintát érkezés/centrifugálás után vizuálisan ellenőrizni kell. • Vizsgálatnak nem megfelelő vérvételi csőbe történt a mintavétel. • Alvadékos minta (mikroalvadék! ) • Nem megfelelő citrát:vér arány

29. A hematokrit hatása a citrát relatív mennyiségére Kamal A H et al. Mayo Clin Proc. 2007;82:864-873

30. Hematokrit és a véralvadási vizsgálatok Alacsony, illetve magas hematokrit esetén téves alvadási eredményeket kapunk. • ha htk>0,55 (55%): fiziológiás újszülöttekben, illetve előfordul olyan betegségekben, ahol a vörösvértest-szám nő (policitémia vera, szívbetegségek), és így a plazma aránya csökken → relatív citrát-túlsúly. Ilyenkor nyitott, hagyományos vérvétel esetén a szokásos citrát:vér arányt módosíthatjuk. A vénás vér megfelelő mennyisége kiszámítható a következő képlet alapján: vér (ml) = 9 x Na-citrát oldat (ml) x 0,55 / (1,00 – hematokrit) • ha htk< 0,25 (25%): a fenti formula alapján módosítandó a helyes arány.

31. Minta minőségi eltérései • Hemolízis • Hyperlipidaemia • Hyperbilirubinaemia

32. Mintatárolás- Hemosztázis • PI esetén 24, egyéb vizsgálatok esetén pedig 4 órán belül végre kell hajtani a méréseket. • Ha a minták csak a későbbiekben kerülnek felhasználásra, a plazmákat le kell fagyasztani. • Trombocitafunkciósvizsgálatok esetén a mintavételt követően azonnal meg kell kezdeni a mérést és két órán belül be kell fejezni.

33. Mintatárolás -Szobahőmérsékletena PI stabilabb, mint az APTI, de a hőfok emelkedésével mindkettő értéke kifejezetten nő (sec). -A leglabilisabb faktor a FVIII -Magashőmérséklet (beleértve direkt napfény) mindenkor kerülendő -Hűtőszekrényben(2-8 oC) való tárolás nem ajánlatos, mivel ez a FVII, valamint FXI, XII hidegaktivációjához, ezáltal a megfelelő szűrőtesztek rövidült alvadási idejéhez vezet

34. Mintatárolás Ha a minta csak a későbbiekben kerül felhasználásra, a trombocitamentesplazmát (PFP) a vérvétel után 1 órán belül leválasztjuk a sejtes elemekről és zárt csövekben fagyasztva tároljuk. Rövid ideig tartó (<2 hét) tárolásra elegendő a – 20 oC, de hosszabb idő esetén (<6 hónap) legalább -70 oC a megfelelő tárolási hőmérséklet. A fagyasztott mintákat 37 oC-os vízfürdőben engedjük fel, majd alaposan összekeverjük. Ezután azonnal megkezdjük a mérést, mivel számtalan faktor stabilitása csökken felolvasztás után. Az újrafagyasztás és –felengedés kerülendő.

35. Mintatárolás-Hematológia • A vérképes mintát 8 órán belül mérni kell, ha szobahőmérsékleten tároljuk • 24 órán belül mérni kell, ha +4Co-on tároljuk • Kenet készítés azonban 4-5 órán belül történjen!

36. Nem megfelelő mintatárolás hatásai • Szobahőmérsékleten való tároláskor 8 óra után bekövetkező változások: - vörösvérsejtek elvesztik bikonkáv alakjukat - MCV ↑, Hct↑ - ozmotikus fragilitás↑ - fehérvérsejt szám↓ - abszolút lymphocyta szám↓ - retyculocyta szám már 6 óra után↓ - magvas vörösvérsejtek 24-36 óra után eltűnnek -MPV↑, IRF↓ • +4Co–on a stabilitás 24 óráig megmarad, kivétel a reticulocyta, trombocyta paraméterek és a qualitatív vérkép!

37. Vérvétel után 12 órával készült kenetek esetén: Neutrophil granulocyták Lymphocyták Monocyták Vörösvérsejtek

38. Mikor utasítható vissza avizsgálatkérés? Ha a minta: • alvadékos • nem megfelelő/elégtelen mennyiség • nem megfelelő a cső a vizsgálathoz • nem megfelelő tárolás/szállítás • címke olvashatatlan, elégtelen jelölés, azonosítási bizonytalanság • (hemolízis)

39. Összefoglalás • Preanalitikai szakban számos tényező befolyásolja a levett vérminta minőségét. • Odafigyeléssel és az előírások betartásával ezen hibák elkerülhetőek és korrekt, pontos eredményeket szolgáltathatunk.

40. Köszönöm a figyelmet !