Il protocollo sperimentale e i calcoli in laboratorio Fabio Fusi

1. Il protocollo sperimentale e i calcoli in laboratorio Fabio Fusi Dipartimento di Scienze Biomediche

2. Il protocollo sperimentale

3. Sprague-Dawley outbred rats Informazioni sull’animale di laboratorio • Specie utilizzata (ratto, topo, cavia, ecc.) • Ceppo • Ditta fornitrice • Sesso • Peso ----> età • Digiuno (sì - no) • Eventuali trattamenti (reserpinizzato, ecc.) • Anestesia • Metodica di sacrificio • Note

4. Informazioni sulle soluzioni preparate • Soluzioni fisiologiche di perfusione • Soluzioni madri • Pesata • Diluizione • Raccomandazioni per la conservazione della soluzione madre • Note (preparare fresca ogni giorno, agitare prima dell’uso, ecc.)

5. Analisi dei risultati • Raccolta dei tracciati, stampati, ecc. • Immagazzinamento dei dati nel computer • Catalogazione • Elaborazione dei dati raccolti • Produzione di un grafico

7. Annotazioni • Le annotazioni/osservazioni spesso forniscono le informazioni più importanti per la comprensione dei risultati e quindi dell’intero esperimento!

8. Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (1) • “Fisiologica” è l’attributo che si associa a numerose soluzioni saline. • NaCl 0.9% = isotonica • La soluzione fisiologica serve a mantenere un organo isolato in vita ed in condizioni stabili • Manipolazione delle proprietà di una soluzione fisiologica

9. Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (2) • La soluzione fisiologica deve: • assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive • O2 • 37°C • corretta composizione ionica • pH • osmolarità

10. Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e delle proteine (g/100 ml) nel plasma di alcune specie

11. Na+ K+ Ca2+ Na+ K+ Ca2+ Na+ K+ K+ Ca2+ K+ Na+ Ca2+ Na+ Ca2+ fenilefrina IP3 Ca2+ Ca2+

12. Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e potenziali di equilibrio nel muscolo scheletrico di mammifero RT [K+]o Equazione di Nerst EK = ------- ln -------- nF [K+]i

13. proteine Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati

14. Le concentrazioni plasmatiche degli ioni presentano specie-specificità Concentrazioni (mM) di calcio “ionizzato” e totale nel plasma di alcune specie

15. +1 pH fisiologico -1 pKa Le soluzioni fisiologiche sono soluzioni tampone • La soluzione tampone: • miscela tra un acido debole e la sua base coniugata • minimizza le variazioni di pH • Perché una coppia coniugata possa essere considerata come un tampone di rilevanza fisiologica: Sufficiente capacità tampone

16. Legge di Henry CO2(gas) CO2(acq.) H2CO3 + HCO3- pK’a = 3.8 H2PO4 + HPO4- pK’a = 7.2 Ca2+

17. A- H+ B+ OH- Il pH Importante per la vitalità e funzionalità del tessuto Determina il grado di ionizzazione delle molecole AH BOH Attività <-----> Inattività Enzimi Livelli di [Ca2+]i Contrattilità muscolare Meccanismi osmotici Ecc.

18. L’osmolarità L’osmolarità di una soluzione deve essere vista come l’effettiva pressione osmotica che questa soluzione può sviluppare sui tessuti. Una osmole = 22.4 atm a 0°C (pressione osmotica di una soluzione 1 M di un non-elettrolita ideale). L’osmolarità di una soluzione reale può essere determinata direttamente dalla misura del punto di congelamento.

19. H2O swelling Soluzione ipo-osmotica

20. H2O shrinking Soluzione iper-osmotica

21. La temperatura Variabile fisiologica strettamente controllata nel vivente Influenza sia la risposta basale di un preparato che la responsività ai farmaci (utero di ratto) La riduzione della temperatura diminuisce il consumo di ossigeno ed il rischio di ipossia Influenza il pH delle soluzioni

22. L’ossigenazione • Importante per la sopravvivenza di un tessuto • Apparato sperimentale, spessore del tessuto, consumo di ossigeno tessutale (temperatura e attività) e pressione parziale di ossigeno nella soluzione fisiologica influenzano l’ossigenazione. • La quantità di un gas disciolto in soluzione dipende da: • solubilità del gas nell’acqua • pressione del gas nella fase gassosa • temperatura • presenza di soluti nell’acqua

23. I calcoli in laboratorio

24. Come si esprime la concentrazione di una soluzione M = n / V con V = litro Dalla molarità ai grammi (1)

25. Dalla molarità ai grammi (2) Come si calcolano i grammi da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti M = n / V con n = g / PM ne consegue che M = g / PM x V ovvero g = M x PM x V

26. La pesata “approssimata” Come si calcolano i g da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti di una sostanza costosa g = M x PM x V Preparare 1 ml di una soluzione di quercetina (PM = 338) 10 mM g = 0.01 x 338 x 0.001 = 0.00338 pesata = 0.00221 g applico la proporzione 0.00338 g : 1 ml = 0.00221 g : X ml

27. La diluizione • Come si prepara una soluzione a concentrazione e volume noti a partire da una soluzione più concentrata • C1x V1 = C2x V2 • 1 indica la soluzione da preparare • 2 indica la soluzione più concentrata • C e V devono essere sempre espressi con la stessa unità di misura

28. dimetilsolfossido etanolo dimetilformammide metanolo Il problema solvente Molte sostanze impiegate nella ricerca di base e pre-clinica sono lipofile.