Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009

1. Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular FarmingDra. María Alejandra Alvarezmalvarez@centromilstein.org.arInstituto de Ciencia y Tecnología Dr. César MilsteinCONICET- Fundación Pablo Cassará Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009

2. Molecular Farming • Se define como una estrategia alternativa de producir moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales) • Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad. • La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año. • Mercado actual: 50 mil millones de U$. • Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.

3. Ventajas • Bioseguridad • Maquinara de síntesis proteica eucarionte • Producción en condiciones controladas (sistemas confinados)

4. Aspectos críticos • Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para resolverlo (humanización de glicoproteínas). • Tiempo: optimización del esquema de producción • DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio). • Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.

5. Sistemas de producción • Planta a campo • Sistemas confinados (cultivos in vitro, invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)

6. Cultivos in vitro • Callos • Cultivos de órganos (raíces, tallos) • Frascos agitados • Bioreactores • Suspensiones celulares • Frascos agitados • Bioreactores

7. Raíces transformadas • Rápido crecimiento • Estado de organización • Estabilidad de producción

8. Inóculo Salida de aire Malla de inmovilización Adición de nutrientes Filtro de aire Bomba peristáltica Rotámetro Bomba de aire Generador de niebla Intensidad Condensador de niebla Aire Aire Reservorio On Off Cámara de cultivo Controlador Bomba Biorreactores para el cultivo de raíces Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las raíces Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor) Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

9. Suspensiones celulares • Frascos agitados • Pequeños volúmenes • Conocimiento del sistema • Estudios para escalado

10. Bioreactores • Volumen 1 -3000 litros • Producción en gran escala • Modelo acorde al sistema y escala de producción

11. Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales

12. Consideraciones para el diseño • Crecimiento y demanda de oxígeno • Estado de agregación y propiedades reológicas • Sensibilidad a las fuerzas de corte • Formación de espuma/ pared celular

13. Crecimiento y demanda de oxígeno • Tiempos de duplicación altos ( 20-100hs) • BY-2: 12 hs • NT-1, Xanthi: 18-24 hs • Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, células animales: 0.02-0.1 x 10-9) • A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno. • Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m3, 20% saturación. • KLa en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: 100-1000; células animales: 0.25-10), rango restringido. • Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), 0.05-0.1 vvm (tanques agitados), altos niveles tóxicos.

14. Agregados-reología • Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc. • Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados • Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).

15. Sensibilidad a las fuerzas de corte • Tamaño celular (largo: 100- 500 µm , diámetro: 20-50 µm) mayor a bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: 5-10 µm), células animales ( diámetro: 10-100 µm) • Alto volumen de vacuolas (90% volumen total) • Pared celular rígida, no- flexible. • Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar) • Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación. • Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados

16. Espuma/pared celular • En la fase de crecimiento exponencial • Exacerbada durante la fase estacionaria • Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de nutrientes y oxígeno: caída de la productividad • Crecimiento en pared, impeler, sensores. • Taponamiento de filtros de aire. • Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.

17. Estrategias para productos intracelulares • Aumento de la tasa de crecimiento • Aumento de la concentración de biomasa • Fase exponencial más extensa • Batch-/batch alimentado a alta densidad celular • Cultivo semi-continuo o continuo para evitar grandes agregados celulares y adhesión a superficies

18. Estrategias para productos extracelulares • Mayor tasa de crecimiento • Mayor concentración de biomasa • Fase exponencial más extensa • Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de alta densidad celular • Recuperación de producto in situ • Mayor estabilidad de proteínas por agregado de aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.

19. Tanques agitados Agitador de paletas planas o Rushton • Pros • Flexibilidad • Altos coeficientes de transferencia de masa • Homogéneos • Aplicable a cultivos de alta densidad • Permite trabajar en GMP • Cons • Sistema de mezclado (shear stress) • Costos • Generación de calor • Riesgos de contaminación en válvulas Agitador de paletas inclinadas

20. Neumáticos: burbujeo • Pros • Fácil de escalar • Bajos costos • Bajos riesgos de contaminación • Sin generación decalor • Bajo shear stress • Cons • Transferencia de oxígeno pobre • Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad • Formación de espuma a alta aireación

21. Neumáticos: airlift • Pros • Direccionamiento del burbujeo • Buena transferencia de oxígeno • Menor shear stress, sin generación de calor • Menores tiempos de mezclado • Menores costos, sencillez de escalado, eficiente circulación de fluidos • Cons • Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad • Formación de espuma a alta aireación

22. Wave • Pros • Shear stress • Transferencia de oxigeno • Costos operacionales • Cons • Escalado • Transferencia de calor • Estrategias operacionales avanzadas

23. De membrana • Pros • Remoción de productos extracelulares • Bajo shear stress • Bajos costos operacionales • Cons • Escalado • Oxigenación • Baja transferencia de calor • Monitoreo on- line

24. Algunos ejemplos comerciales

27. Eco-Pod Reactor temporario para algas. Producción de biocombustibles.

29. Muchas gracias por su atención malvarez@centromilstein.org.ar