实验十三组织培养与病毒的细胞感染法

实验十三组织培养与病毒的细胞感染法 • 练习内容 • 1．鸡胚纤维母细胞培养法（示教） • 2．病毒的空斑形成试验（示教） • 3．致细胞病变作用的观察（示教）

目的要求 • 1．了解细胞培养的原理与方法 • 2．了解病毒空斑形成试验方法与意义 • 3．了解病毒对细胞致病变作用的类型。

一、单层细胞培养法 • （一）鸡胚纤维母细胞培养法 • （二）人胚肾细胞培养法 • 二、人双倍体细胞培养法双倍体细胞株，是一种能在体外分裂50代左右而—直保持其双倍染色体的单层细胞，人双倍体细胞来源可以是人胚肺（4个月以内的胎儿）或人胚肾

三、传代细胞培养法 传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双倍体细胞转化而来，实验室常用从人瘤细胞建立起来的传代细胞如Hela细胞，KB细胞、 HEP—2细胞已广泛地应用于病毒实验。这些传代细胞系的最大特点是通过规律地间隔传代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮四、器官培养

五、病毒的细胞感染法 在单层细胞上测定病毒的方法有多种，常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑形成抑制试验. 六、细胞致病作用的观察细胞致病作用也称“细胞病变作用” （Cytopathic-effect，CPE），根据病毒和感染细胞的不同，细胞病变作用大致上可以分不同三个类型。

（一）全变型 • 指整个细胞都发生改变，常表现为（1）细胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变性、胞膜边缘不整齐，或（2）整个细胞发生碎裂、皱缩、变圆、脱落。 • （二）包涵体型 • 有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体（见表13—3）。 • （三）融合型 • 有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等）可使多数病变细胞间相互发生融合而呈 “巨细胞”（但各个细胞的胞核仍可分辨）。

【结果观察】 • 纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变程度： • （－） —无细胞病变； • （+） —25％以下的细胞有病变作用； • （++）一50％的细胞有病变作用； • （+++）一75％左右的细胞有病变作用； • （++++）一75％以上的细胞有病变作用；

某些病毒引起细胞病变的主要特征(表13—2 )

实验十四病毒的血清学试验 • 血清学试验的方法很多，一股实验室最常用的是中和试验，补体结合试验和红细胞凝集及凝集抑制试验。近年来免疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接红细胞凝集试验、琼脂扩散试验以及红细胞吸附抑制试验等技术，也成为实验室病毒诊断的常规技术。

练习内容 • 1．病毒的血球凝集试验 • 2．病毒的血球撬集抑制试验

目的要求 • 1．了解病毒的血清学试验方法与原理 • 2．掌握病毒的血凝试验和血抑试验的方法与结果判读 • 血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的基本方法之一。

三、病毒的血球凝集与血球凝集抑制试验 • 某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，见表玉14一4。当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点 .这里我们以新鸡城瘟病毒 NDV为例介绍血凝和血凝抑制试验。

【材料】 • 新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液 1份 • 0.5％鸡血球悬液 1管 • 生理盐水或PBS 1瓶 • 96孔微量血清盘 1块 • 微量稀释棒 1支 • 无菌试管 1支

【方法】 • 1．在微量血清盘的末孔标记为对照孔。 • 2．各孔中加生理盐水25微升。 • 3．取病毒鸡胚尿囊液（经离心）0.1毫升加入无菌试管，然后加生理盐水0.9毫升（即1∶10稀释）。 • 4．取1∶10病毒稀释液25微升加入第1孔，再吸25微升置2孔，用微量稀释棒捻转20次……依次稀释，直至第9孔弃去25微升。 • 5．各孔中加0.5％鸡红血球25微升充分摇匀。 • 6．置室温经30分钟，40分钟，1小时各观察一次结果。以45分钟为准。

新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺序(表14-5 )

孔列 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 病毒稀释度 1∶10 1∶20 1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 1∶1280 1∶2560 对照生理盐水（μl） 25 25 1∶10病毒悬液（μl） 25 25 25 25 25 25 25 25 25 — 弃去25 0.5%鸡红血球（μl） 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 摇匀后，置室温静止30—50分钟 25 25 25 25 25 25 25 25

【结果判读】 • 各孔出现的血球凝集程度以+++、+++、++、++、+、—表示。 • ++++为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底； • +++约有50％血球发生凝集； • ++约有50％血球发生凝集； • +约有25％血球发生凝集； • —不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小点，边缘光滑，圆润。 • 血凝试验的结果以50％血球凝集（++）的最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即为1个血凝单位。

血球凝集抑制试验 • 【材料】 • 除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。

【方法】 • 1．血凝素单位的配制和调配 • 2．住微量血清盘上编号，并设血清对照、病毒（血凝集）对照和血球对照孔．然后2—11孔中各加生理盐水或PBS25微升。． • 3．将1∶10血清加入1、2、9孔，并从第2孔起作一系列倍比稀释至1∶1280或更高的稀释度，每孔为25微升。 • 4．按操作简表加入4单位血凝集。

6．混匀，在室温下作用20分钟。 • 7．各孔中滴加0.596鸡血血球悬液50微升。 8．在血清对照、病毒（血凝素）对照，血球对照孔中滴加生理盐水或PBS各25微升。 • 9．混匀后，在室温下静止，30分钟，60分钟各观察一次结果。一般以60分钟结果为准，但如果血球下滑显著，则以30分钟结果判读。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 血清稀释度 1∶10 1∶20 1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 1∶1280 血清对照病毒对照血球对照生理盐水（μl） NS 25 50 稀释的血清（μl） 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃去 — — 4单位血凝（μl） 25 25 25 25 25 25 25 25 — 25 — 摇匀后，置室温静止30—50分钟 0.5%鸡红血球（μl） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 25 25 25 25 25 25 25

1．根据各孔血球凝集程度，以“++++、+++、++、+，－”表示。1．根据各孔血球凝集程度，以“++++、+++、++、+，－”表示。 • 2．查看各对照孔：血清对照不凝集（－）：病毒对照为完全凝集（++++），血球对照则应不凝集（—）。 • 3．以出现完全抑制血球凝集（即不凝集）的最高血清稀释度为其最终滴度。例如 • 稀释倍数：1∶10 l∶20 1∶40 l∶80 1∶160 1∶320 l∶640 1∶1280 • 结果：－－－－－ ++ +++ ++++ • 此血清血凝抑制滴度为1∶160，结果判读】

实验十五病毒的快速诊断 • 目的要求 • 1．初步掌握电镜下病毒的基本形态 • 2．了解ELISA的原理、方法及结果判读

练习 • ELISA

酶联免疫吸附试验 • （Enzyme Linked immunosorbent assay， ELISA） • ELISA是当前各实验检测抗原抗体最常用的方法之一，也是进行病毒快速诊断的重要手段。它具有灵敏度高（10－9一10－12克），特异性强、操作简便、易于观察、便于现场大规模检查。

ELISA的种类有许多种，但用于病毒快速诊断常用间接法和双抗体夹心法

（一）间接法（indirect method） • 1．抗原包被纯化抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液适当稀释后，在微量凹孔板上，每孔加100微升，置湿盒中4℃过液，洗涤三次。 • 2．加待捡血清每孔加100微升适当稀释的待检血清，置湿盒中，37℃2小时。洗涤三次。 • 3．加酶结合物每孔加100微升酶标记抗人Ig，置湿盒中，37℃2小时。洗涤三次。 • 4．加底物每孔加底物100微升，置湿盒，37℃30分钟。 • 6．加终止液100微升。 • 6．读取结果。

（二）双抗体夹心法（Double antibody sandwich method） • 1．抗体包被已知抗体用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1—10微克／毫升，在微量凹孔板上，每孔加100微升包被，置湿盒4℃过夜。洗涤三次。 • 2．加待检标本每孔中加含抗原的待检标本100微升置湿盒37℃小时。洗涤三次。 • 3．加酶结合物每孔加酶标记的特异性抗体100微升置湿盒37℃小时。洗涤三次。 • 4．加底物 • 5．加终止液 • 6．读取结果

【结果判读】 • 用酶标测定仪测在492nm下各标本光密度OD值。 • ELISA的结果易受到各种因素影响，因此每次试验（每一块试验板）都设阳性对照，阴性对照、稀释液对照、阳性对照OD值≥1.0，阴性对照OD值≤0.2，结果用P／N值表示。 • P/N值1.5-2.1者为可疑 • P／N值<1.5为阴性 P／N值≥2.1者为阳性

实验十三组织培养与病毒的细胞感染法