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UNIVERSIT À DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia PowerPoint PPT Presentation


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UNIVERSIT À DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute. ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DA SANGUE DEL CORDONE OMBELICALE. Relatore: Prof. Roberto Sala

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Presentation Transcript


UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA

Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia

Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute

ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DA SANGUE DEL CORDONE OMBELICALE

Relatore: Prof. Roberto Sala

Tutore: Dott. Stefano Negri

Laureando: Arianna Beduschi


CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI

Cellule staminali adulte multipotenti

Fonti delle MSCs

Capacità di aderire a superfici di plastica

Capacità di differenziare:

Adipociti; osteociti; cellule muscolari;

Altro:neuroni, epatociti…

  • Espressione di markers specifici

  • POSITIVI: CD90; CD73; CD105; CD44; CD29; HLA-ABC

  • NEGATIVI: CD34; CD45; CD14; HLA-DR


Agoaspirato midollare

Tessuto adiposo

Sangue e tessuti cordonali

Placenta

FONTI DI MSCs


IL SANGUE CORDONALE COME FONTE DI MSCs

  • tessuto di scarto

  • presenza di staminali mesenchimali ed emopoietiche

  • MSCs da UCB hanno le stesse caratteristiche di quelle isolate da midollo

  • uso autologo ed allogenico

  • dibattito tra ricercatori sull’accessibilità alle MSCs: difficoltà d’isolamento

  • meno MSCs rispetto midollo e Wharton’s jelly


B.A.M.C.O.:

Banca Autologa-Allogenica Mantovana

del Cordone Ombelicale

Obiettivo:

tutelare sempre il diritto della madre a conservare il proprio sangue del cordone ombelicale per uso autologo e al tempo stesso garantire la possibilità di donare tale sangue per uso allogenico


Arrivo sacca sangue cordonale

  • Calcolo del volume netto di sangue cordonale raccolto:

  • Peso lordo sacca – peso sacca ( tara = 28 g) = peso netto sacca

  • Peso netto sacca / peso specifico sangue (1.05 g/ml) = volume sacca con anticoagulante

  • Volume sacca con anticoagulante – volume anticoagulante (20 ml) =

  • volume netto sangue cordonale

Aliquota per la ricerca: attenzione a NON pregiudicare mai la conservazione del sangue raccolto sia per uso autologo che allogenico!


  • Analisi multiparametrica al citofluorimetro:

  • CD 34 – APC

  • CD 45 – PERPC

  • CD 90 – FITC

  • CD 73 - PE

  • Analisi multiparametrica al citofluorimetro:

  • CD 34 – APC

  • CD 45 – PERPC

  • CD 90 – FITC

  • CD 73 - PE

Cellule MSCs-like

Cellule MSCs-like

Plasma

Sangue intero

Cellule mononucleate

Histopaque

Eritrociti

Histopaque

Prelievo 0,5 ml per emocromo e analisi multiparametrica al citofluorimetro

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ CON HISTOPAQUE-1007


Cellule mononucleate

SELEZIONE NEGATIVA DELLE CELLULE

Utilizzo di biglie paramagnetiche rivestite di Ab CD34.

Selezione negativa delle MSCs in quanto tali cellule non esprimono CD34.


COLTURE CELLULARI

IMDM + 10%FBS + bFGF 10ng/ml+ ITS+ 50 mg/ml


I dati forniti dall’emocromo e dall’analisi multiparametrica al citofluorimetro sono stati utilizzati per calcolare la % di MSCs sulla frazione di cellule mononucleate nel sangue e dopo estrazione con Histopaque.

La procedura di gating applicata è stata:


sample

% MSCs /cell mono

nel sangue

% MSCs/cell mono

dopo estrazione Histopaque

Cordoni di peso superiore a 90 g:

Cord 10

0,058

0,074

Cord 11

0,078

0,040

Cord 12

0,119

0,014

Cord 13

0,152

0,132

Cord 15

0,010

0,140

media

0,083 ± 0,055

0,080 ± 0,055

Cordoni di peso inferiore a 90 g:

Cord 18

0,078

0,382

Cord 19

0,029

0,306

Cord 20

0,092

0,177

media

0,066 ± 0,033

0,288 ± 0,104

RISULTATI


RISULTATI

Efficienza di estrazione : (42,19 ± 16,37) %


RISULTATI

All’aumentare del volume di sangue cordonale raccolto aumenta la quantità di MSCs-like presenti.

In proporzione la resa d’estrazione con Histopaque rimane la stessa.


RISULTATI

La percentuale di MSCs-like diminuisce nel sangue intero con l’aumentare del tempo trascorso tra raccolta e lavorazione.

I tempi migliori per l’estrazione con Histopaque sono tra 5 e 15 h.


RISULTATI

Si ottengono colture dal 13% dei cordoni analizzati, percentuale che sale al 33,3 % se si considerano solo i cordoni di peso > 90g.


CONCLUSIONI

  • L’analisi multiparametrica al citofluorimetro dimostra la presenza di cellule MSCs-like sia nel sangue cordonale che nella frazione di cellule mononucleate da esso ottenute.

  • Con l’estrazione mediante centrifugazione in gradiente di densità non si perdono MSCs-like, anzi in alcuni casi aumenta la %.

  • All’aumentare del volume di sangue raccolto aumenta la % di MSCs-like.

  • Si ottengono colonie di MSCs-like solo da cordoni molto abbondanti, generalizzando con volume > 40 ml.

  • I tempi migliori per la lavorazione del sangue cordonale sono tra 5 e 12 ore MA sono state ottenute colonie di MSCs-like da un cordone lavorato + di 24 h dopo la raccolta.?

  • La coltura di MSCs-like è difficoltosa.


Cautela nel generalizzare i nostri risultati perché ottenuti su un ristretto numero di cordoni e su volumi ridotti in alcuni casi:

Infatti sempre, in ogni caso, sono stati tutelati i diritti della madre e del neonato e la possibilità di donare il sangue cordonale per uso allogenico.

Probabilmente se ci fosse la possibilità di lavorare tutto il sangue di una sacca idonea al congelamento la % di cordoni ombelicali da cui si ottengono colonie di cellule MSCs-like aumenterebbe.


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