1 / 14

DNA restriktsioonanalüüs

DNA restriktsioonanalüüs. DNA molekuli lõikamine ehk nukleotiididevahelise keemilise sideme lõhkumine restriktsiooniensüümi abil. Restriktsiooniensüümid. LÕIKAVAD SPETSIIFILIST KOHTA DNA-l Koht, mille restriktsiooniensüümid ära tunnevad, võib olla 4, 5, 6 või 8 nukleotiidi

meda
Download Presentation

DNA restriktsioonanalüüs

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNA restriktsioonanalüüs DNA molekuli lõikamine ehk nukleotiididevahelise keemilise sideme lõhkumine restriktsiooniensüümi abil

  2. Restriktsiooniensüümid LÕIKAVAD SPETSIIFILIST KOHTA DNA-l Koht, mille restriktsiooniensüümid ära tunnevad, võib olla 4, 5, 6 või 8 nukleotiidi pikk. Mõnede ensüümide puhul on see koht ka pikem, mõnede puhul lühem. nn tömbid otsad nn kleepuvad e üleulatuvd otsad fosfodiesterside lõhutakse

  3. Milleks kasutatakse restriktsioonanalüüsi? Molekulaardiagnostikas – näiteks on võimalik määrata, kas organism on teadud geeni osas homo – või heterosügootne – kas emalt ja isalt saadud geenivariandid on ühesugused või erinevad. Ühte alleelivarianti on restriktsiooniensüüm võimeline lõikama, teist aga mitte. Seda vahet on võimalik detekteerida. Geenitehnoloogias – äärmiselt oluline meetod kloneerimisel, töös kasutatavate DNA molekulide kontrollimisel, mutatsioonide kindlaksmääramisel (restriktsioonikohtade kadumise või tekkimise kaudu).

  4. MIDA ME TÄNA TEEME? • LÕIKAME PLASMIIDSET DNA-d KOLME ERINEVA ENSÜÜMIGA • VALAME AGAROOS-GEELI (1 %) • KANNAME RESTRIKTSIOONIPRODUKTID GEELILE • JOOKSUTAME DNA-d GEELIS • PILDISTAME GEELI ULTRAVIOLETTVALGUSES • ANALÜÜSIME SAADUD RESTRIKTSIOONIPILTI

  5. GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACT TCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTC TCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTT TAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGG TCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGAC TTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAA ATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCAT AGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAACTCGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAG CCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATA AAAAAAATTAGTCAGCCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGG ATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCTGCATTAATGAA TCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCA CTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGG TAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCC AGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCC CCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGAC TATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCC TGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATA GCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGC ACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCA ACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAG CGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTA GAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTG GTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGC AGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGT CTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAA GGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA TCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATAC GGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGG CTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTG CAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTT CGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCT CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGAT CCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTA AGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCA TGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAAT AGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCAC ATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAA GGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTT CAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCG CAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAAT ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTT AGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCT AAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC GTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGG TCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGG GTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG TGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGA AATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATT TTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGAT AGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAA CGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTA ATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCC CCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGC GAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCAC ACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCG CAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGG GGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTG TAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGGTTACATAAC TTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGT ATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCC CTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTAT GGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGC GGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTC TCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAA AATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGG TCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCT GTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGGGGATCTTGGTGGCGT GAAACTCCCGCACCTCTTCGGCCAGCGCCTTGTAGAAGCGCGTAGGCCTTCTAGAATGGA GGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCT ATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA TTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGA AGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACC GGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAAC CTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGT GACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCC TGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCAT CTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTG CTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCG TGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCC GCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTG CATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGG TAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCATGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCG GCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGG GAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACC ACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG AGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAG CAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAA ACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGAG

  6. nukleotiidi järjekorra- number, mille juurest ensüüm lõikab 469 4247 5295 Eco147I AGG-CCT 2521 2957 5235 SspI AAT-ATT PvuII CAG-CTG 3470 4688

  7. Restriktsioonisegu koostis: • DNA, mida lõigata • ensüüm, mis lõikab • puhverlahus,mis loob ensüümile töötamiseks vajalikud tingimused • vesi – viimaks reaktsioonimahtu soovitud ruumalani N: punase puhvri koostis: 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 mM NaCl 0,1 mg/ml BSA pH 7,5 rohelise puhvri koostis: 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 50 mM NaCl 0,1 mg/ml BSA pH 7,5 sinise puhvri koostis: 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 0,1 mg/ml BSA pH 7,5 kollase puhvri koostis: 33 mM Tris-acetate 10 mM Mg-acetate 66 mM K-acetate 0,1 mg/ml BSA pH 7,9 Laias laastus arvestatakse, et 1 μg DNA lõikamiseks kulub 1 U (ühik) ensüümi. Standardselt toimub restriktsioonireaktsioon 37 kraadi juures 1 tund. Aga tegelikult saab ka kiiremini. Näiteks mikrolaineahjus, külmas vees, mõne minutiga :)

  8. Elektroforees DNA fragmentide lahutamine agaroosgeelis suuruse järgi. Toimub nn elektroforeesivannis, millesse tekitatakse elektrivool. Elektroforeesivann on täidetud puhvriga, mis juhib elektrit. Selle puhvri sisse asetame geeli (valmistatud agaroosist ja samast puhvrist, milles geeli jooksutame). Geelile kanname restriktsioonil saadud DNA fragmendid. DNA-le lisame enne geelile kandmist nn pealekandmisvärvi – see aitab DNA-l jääda geelil olevasse süvendisse (kaevukesse) ning samuti võimaldab meil näha, kui kaugele DNA jupid on jooksnud. Geelile endale on lisatud ka värvi (antud juhul etiidiumbromiid), mis seondub kaheahelalise DNA-ga ja helendab ultraviolettkiirguses.

  9. Agaroos – polüsahhariid (agar, agar agar) saadakse vetikatest Agaroosi polümeerid moodustavad tiheda võrgustiku, mille DNA molekulid peavad elektrivoolu toimel läbima. Mida suurem molekul, seda raskem on tal läbi tiheda võrgustiku tungida. Väiksemate molekulide jaoks on geeli läbimine kergem, sest takistus on väiksem ning seepärast saavad nad liikumisega kiiremini hakkama ja jõuavad alguspunktist kaugemale kui suuremad molekulid. Rõngasmolekul läbib samuti geeli kiiremini kui tema lineaarne või üheahelalise katkega vorm (nicked DNA).

  10. DNA marker (referents/ladder) * kindla (teadaoleva) pikkusega DNA juppide segu * aitab tuvastada restriktsioonil tekkivate DNA fragmentide pikkust

  11. + MARKER MARKER 250 500 500 750 750 1000 1000 1500 1500 2000 2500 2000 2500 3000 3000 4000 4000 6000 6000 sirgeks lõigatud plasmiid lõikamata plasmiid grupp 3 grupp 1 grupp 2 - erinevate ensüümidega lõigatud plasmiidne DNA

  12. MARKER MARKER 250 436 500 612 500 750 750 1048 1000 1000 1218 1500 2000 2278 2500 2000 2500 5438 3000 3778 3000 4220 4000 2724 5438 4000 6000 6000 sirgeks lõigatud plasmiid Eco 147I lõikamata plasmiid Pvu II SspI erinevate ensüümidega lõigatud DNA

  13. http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/gel/ animeeritud DNA geeli jooksutamine http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html animeeritud restriktsioon http://www.biotech.ebc.ee/Antsu_loengud/Loeng2_2007.pdf eestikeelset teksti restriktsiooniensüümide kohta signe.varv@ut.ee

More Related