Proteomika – nová dimenzia v poznaní genetických porúch

1. PROTEOMIKA OCHORENÍ – má potenciál zachytiť patológiu vo včasnom štádiu, určiť presnejšie etiopatogenézu a individuálnu variabilitu molekulárnych fenoménov. Bude zohrávať významnú úlohu pri objasňovaní mechanizmov nádorových, neurodegeneratívnych, psychických (Alzheimerova, Parkinsonová choroba, schizofrénia?), zápalových a metabolických ochorení. Najrýchlejší rozvoj sa dá pozorovať v onkoproteomike. Prežívanie, rast, invazívnosť nádorových buniek – v základoch genetického defektu musí byť aj alterácia funkčných proteínov. Proteomický prístup prinesie iste podstatné informácie aj o pozmenených bunkových signalizačných dráhach. KLINICKÁ PROTEOMIKA – cieľom je odhaliť, nájsť proteíny, ktoré budú mať medicínsky význam. Pôjde o proteíny, ktoré sa budú dať využiť ako diagnostické markery vďaka tomu, že ich expresia za špecifických fyziologických a patologických podmienok bude výrazne zvýšená (zápalové, infekčné, nádorové ochorenia). Porovnanie parametrov senzitivity a špecificity väčšiny doterajších onkomarkerov s proteomickými markermi favorizuje využitie proteomických markerov. FARMAKOPROTEOMIKA – spoznanie špecifických zmien proteómu pri rôznych ochoreniach môže mať vplyv pri rozhodovaní o výbere vhodnej terapie. Súčasne efektívnosť terapie a toxicita by mohli byť sledované na úrovni zmien spektra proteínov a ich funkčného stavu. PROTEOMIKA – PREDMET ŠTÚDIA A VÝSKUMU: Charakterizácia všetkých proteínov, nachádzajúcich sa v bunke, v tkanivách, v organizme a to z hľadiska kvantity, štruktúry, funkcie a ich vzájomnej interakcie. HUPO – Human Proteome Organisation – má integrovať a podporiť proteomický výskum. DEFINOVANIE CIEĽOV PROTEOMIKY: Štúdium proteínov, určenia ich množstva, primárnej štruktúry, vyšších štruktúr, ich funkcie a zmien pri odlišných podmienkach nie je novou úlohou biologických vied. Na prelome 20. a 21. storočia sa však začali výraznejšie presadzovať v tomto snažení dva nové momenty. Napriek významnému prínosu molekulárnej genetiky stále na mnohé otázky nevieme dať uspokojivú odpoveď, vrátane odpovede na otázku aké a koľko funkcii plní jeden gén. Ak by totiž jeden gén zodpovedal iba za jeden finálny produkt, potom by človek mal nie viac ako 25 000 proteínov. Nakoľko sú proteíny stredobodom pri pochopení bunkových funkcií ako aj chorobných procesov, bez poznania vzťahov medzi génmi a proteínmi nemožno efektívne využiť poznatky genómovej éry. V roku 1994 úloha proteomiky bola zadefinovaná ako identifikácia a charakterizácia všetkých proteínov exprimovaných v organizme (tkanive), čoskoro však bolo zrejme, že jej úlohou je aj určenie množstva, funkcie, lokalizácie a posttranslačnej modifikácie týchto proteínov prítomných v bunke v danom momente. Pravda ani táto úloha nebola dostatočne stanovená, pretože nedocenila pôsobenie environmentálnych, metabolických, farmakologických, genetických a patologických podmienok na proteóm. Ďalším závažným momentom pre vytýčenie vyššie uvedených cieľov sa stali aj nevídané metodické možnosti separácie a analýzy proteínov pomocou robustnej techniky, ktorá je schopná požadované proteomické údaje poskytnúť omnoho rýchlejšie, spoľahlivejšie a presnejšie. Dnes sme si vedomí toho, že cesta od genomiky k proteomike by nebola možná bez aplikácie zdokonalenej špeciálnej techniky, využívajúcej princípy hmotnostnej spektrometrie. Pravdepodobne neexistuje žiadna iná súčasná technika, ktorá by prekonala hmotnostný spektrometer v rôznorodosti aplikácií v základnom i aplikovanom výskume ako aj v diagnostike. Proteomika – nová dimenzia v poznaní genetických porúch PROTEOMICKÉ METÓDY A CIELE PROTEOMICKÉHO PRÍSTUPU Globálna analýza proteínov je nosným cieľom proteomického prístupu. K naplneniu tohto cieľa sa využívajú metódy sodium-dodecyl-sulfát polyakrylamidovej gélovej elektroforézy (SDS-PAGE), dvojrozmerná ELFO (2D-PAGE), Western blot, proteínové biočipy, hmotnostné spektrometrie (MS) typu – elektospray ionozácia (ESI-MS), matrix-asistovaná-laserová desorpčná ionizácia spojená s detekciou doby letu (MALDI-TOF) a detekciou fragmentov pomocou tandemovej MS (MALDI-MS-MS). Pre identifikáciu proteínov je nevyhnutné využívanie rozsiahlych databáz a výkonnej výpočtovej techniky. Takzvaný ,,bottom-up,, prístup sa v súčasnosti prednostne využíva pri identifikácii proteínov. Prístup zahŕňa izoláciu proteínov pomocou 2D-PAGE, excíziu vzorky z gélu a natrávenie proteínov na menšie fragmenty. Po týchto krokoch nasledujú analýzy pomocou hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF a MALDI-MS-MS. Analýza umožňuje získanie údajov o hmotnosti a hmotnostných spektrách fragmentov a ich porovnanie so sekvenčnými databázami (peptide mass fingerprinting). PREČO NIE JE POČET PROTEÍNOV ZHODNÝ S POČTOM GÉNOV Vďaka molekulárnej genetike a jej metódam poznáme zloženie genómu (sekvenciu nukleotidov) mnohých mikroorganizmov, modelových vyšších organizmov ako aj genóm vlastného druhu. Nukleotidová štruktúra génu je však iba chemická informačná matrica - templát. A hoci je táto informácia pre naše poznanie a prax nesmierne cenná, nedáva nám uspokojivú odpoveď na otázku aký je v skutočnosti funkčný rádius tejto informácie. Možno aj s rozčarovaním sme prijali fakt, že náš genóm pozostáva iba s približne 25 000 génov a nie zo 100 000 ako sa pôvodne predpokladalo. Na druhej strane existujú odhady, že celkový počet proteínových variant, vrátane posttranslačne upravených, môže predstavovať u človeka až 300 000. Ako by sa dalo z daného počtu génov vyprodukovať väčšie množstvo proteínov? Súčasné známe možnosti riešenia tohto paradoxu sú na úrovni RNA ako aj na úrovni už syntetizovaných proteínov. Súčasné známe mechanizmy vzniku viacerých proteínových variant z jedného génu zásahom na úrovní pre mRNA. Niektoré primárne transkripty (pre mRNA) podliehajú alternatívnemu zostrihu, ktorý umožní vznik dvoch alebo viacerých typov mRNA. Polyadenylácia môže ovplyvniť taktiež definitívnu štruktúru mRNA. Uvedené procesy sú znázornené na obrázku. Súčasné známe mechanizmy vzniku funkčne odlišných proteínových variant posttranslačnou úpravou – kovalentná modifikácia proteínov. Pod takéto zmeny spadajú acetylácie, fosforylácie, adenylácie, adenozyl-ribozylácie, glykozylácie a podobne. Ďalšie zmeny môžu byť spôsobené odštiepením časti reťazca alebo modifikácie AMK zvyškov. Niektoré z uvedených mechanizmov sú znázornené na obrázku. Analýza proteínov a peptidov pomocou MS sa stala možnou až koncom 20. storočia, kedy sa stali dostupné zariadenia umožňujúce ionizáciu veľkých molekúl pomocou ESI a MALDI. Metódy ionizácie sa skombinovali s analyzátormi typu quadrupol, iónová pasca a TOF. Umožnila sa analýza veľmi malých látkových množstiev proteínových vzoriek (1pmol). Takéto zariadenie pozostáva z časti pre umiestnenie vzorky (miesto pre terčík resp. injektor), laseru, ionozačnej komory, iónového detektoru a analyzátorov vyššie uvedených typov, resp. ich kombinácií. Samozrejme súčasťou je výkonný počítač s databázou spektier. Princíp ESI hmotnostného spektrometra Princíp MALDI-TOF hmotnostného spektrometra prevzaté www.google.com prevzaté Clark (citácia č.1, poster C10) Pri ESI vzorka proteínov rozpustená v rozpúšťadle, v objeme približne 1 l, je umiestnená v kapiláre. Kónicky zúžená kapilára umožňuje rýchlosť prietoku vzorky 20-40 nl /min, objem vzorky môže byť analyzovaný až 1 hodinu. Tekutina sa dostáva do elektrostatického poľa, rozpúšťadlo sa vyparuje a postupne dochádza k rozbitiu častíc. Opakovanie tohto procesu umožňuje získať ióny proteínov, ktoré sa pohybujú vo vákuovej trubici tzv. zóny postupu a ich pohyb je usmerňovaný elektrickým poľom. Tento typ ionizácie a hmotnostných analyzátorov umožňuje analýzu proteínov s M do 5000. Pri MALDI sa vzorka rozpustí v objeme približne 1-2 l a zmieša sa s rovnakým objemom matrixového roztoku, obsahujúceho organickú látku (napr. 3,5-dimetoxy-4-OH-škoricovú alebo 2,5-dihydroxy-benzoovú kyselinu). Roztok vzorky sa nanesie na terčík a vysuší sa pri laboratórnej teplote. Kryštáliky vzorky sú rozbíjané laserom na malé ióny a uvoľňované z terčíka. Ióny sa pohybujú vo vákuovej trubici a pohyb je usmerňovaný elektrickým poľom. Čas, za ktorý ióny dosiahnú detektor je úmerný druhej mocnine pomeru hmotnosť /náboj (m/z). Menšie proteíny teda dosiahnú detektor omnoho skôr ako väčšie (time of flight) na základe čoho môžeme určiť ich hmotnosť . Tento typ MS umožňuje analýzu proteínov s M až do 100 000. ŠTRUKTURÁLNA PROTEOMIKA – jej cieľom by malo byť určenie štruktúry, množstva proteínov vrátane podielu posttranslačne modifikovaných molekúl, vzájomných proteínových interakcii, ako aj vzťahu proteínových variant ku štruktúre génu. Možno povedie aj k vytvoreniu proteínových máp pre rôzne typy buniek pri odlišných fyziologických a patologických stavov. FUNKČNÁ PROTEOMIKA - množstvo jednotlivých proteínov je ovplyvnené transkripčnými faktormi. Sú to faktory, ktoré vstupujú do jadra a viažu sa na špecifické úseky DNA (enhancery, promótory). Tieto faktory môžu interagovať priamo alebo nepriamo s transkripčným aparátom. Ďalej je tu vplyv epigenetických faktorov (impriting spôsobený rozdielnou metyláciou génov-aliel). Funkčný stav proteínov možno vysvetliť aj posttranslačnými úpravami proteínov, zvlášť fosforyláciami, glykozyláciami. Funkčná proteomika bude nápomocná pri objasňovaní enzýmovej katalýzy, transportných funkcií, imunity, prenosu nervových impulzov, regulácii rastu a diferenciácii buniek. Mohla by prispieť aj k objasneniu procesov starnutia a rôznej predispozícii k ochoreniam. ZÁVER Spoznanie štruktúry ľudského genómu umožnilo molekulárnej medicíne zvýrazniť prediktívnu a preventívnu úlohu. Aplikácia proteomického programu tieto dôležité medicínske prístupy zvýrazní a rozšíri pole ich uplatnenia. Orientácia na genomiku a proteomiku sa stáva dôležitým kritériom pokroku a strategickou sférou v ekonomickom rozvoji krajín. Nikto si nevie predstaviť situáciu, že by v SR v žiadnom zdravotníckom zariadení nebola NMR technika. Avšak žiadne zdravotnícke zariadenie v SR nemá toho času proteomickú techniku typu ESI-MS alebo MALDI-TOF. Proteomika sa teda v súčasnosti neuplatňuje v SR ani v medicínsky orientovanom výskume, ani v klinickej praxi. Cieľom tejto expozície je poskytnúť informácie o súčasných možnostiach genetiky, ale aj poukázať na slabé stránky v rozvoji tohto odboru v SR. Napredovanie spoločnosti v takých strategických odvetviach, ako je genomika a proteomika, je vecou celospoločenského záujmu i konsenzu a tento rozvoj by mala podporovať každá vláda.