Progetto Biotechnologies

1. Progetto Biotechnologies Prof.ssa montemarani E Prof.ssa goia Lavoro a cura di Martina Ballatore

2. Indice • Appunti del corso • Approfondimenti: • Bioetica • Topi transgenici • Cellule staminali 1 – 2 • La clonazione 1 – 2 • Terapia genetica 1 – 2 • Microrganismi patogeni • Laboratorio di inglese: • Gel electrophoresis • DNA Extraction

3. Appunti Biotecnologie Martina Ballatore Clarissa Rebaudo

4. Fasi sviluppo genetica

5. CLONAZIONE E PCR

6. Clonazione dei geni I passaggi fondamentali della clonazione dei geni (amplificazione della sequenza di DNA): • Il gene da clonare viene inserito in una molecola di DNA circolare chiamata vettore, per produrre una molecola di • DNA ricombinante. • Il vettore trasporta il gene in una cellula ospite, che generalmente è un batterio perché prolifica rapidamente. • Il vettore si moltiplica dentro alla cellula ospite, producendo numerose copie uguali • Quando la cellula ospite si divide, alla progenie vengono passate copie della molecola di DNA • ricombinante e il vettore si replica ulteriormente.

7. PCR • La PCR si svolge in una singola provetta, mescolando DNA con una serie di reagenti, che poi sarà inserita in un termociclatore (strumento che permette di incubare la miscela a una serie di temperature diverse). • Le fasi della PCR: • La miscela che vado a considerare (incognita) viene scaldata a 90°, in modo tale che i legami a idrogeno vengano separati. • La miscela viene raffreddata a 50°, i filamenti di ogni molecola possono unirsi, ma non lo fanno perché i primer si attaccano alla molecola di DNA. • La temperatura viene alzata a 70° e si ha una sintesi di DNA, quattro filamenti di DNA invece che due. • La temperatura viene alzata a 90°,le molecole a doppio filamento si denaturano in singoli filamenti. Riinizia il ciclo e si ottengono otto filamenti.

9. Cosa succede dopo la PCR?

10. Studio dei prodotti della PCR La PCR è il punto di partenza per una lunga serie di esperimenti in cui il prodotto dell’amplificazione è studiato in vari modi per ottenerre informazioni sulla molecola di DNA che ha agito da stampo iniziale. Le tre tecniche più importanti per studiare i prodotti della PCR sono: Elettroforesi in gel dei prodotti della PCR 1 Clonazione dei prodotti della PCR 2 Sequenziamento dei prodotti della PCR 3

11. Elettroforesi in gel dei prodotti della PCR

12. Clonazione dei prodotti della PCR

13. Sequenzionamento dei prodotti della PCR

14. MANIPOLAZIONE DI DNA

15. Manipolazione di DNA purificato Una volta che sono stati preparati i campioni di DNA puri, bisogna costruire la molecola di DNA ricombinante tagliando il suo vettore e la molecola in punti specifici. Queste manipolazioni sono alla base della clonazione di un gene, e necessitano tutte di enzimi purificati

16. Enzimi di manipolazione di DNA Nucleasi 1 Ligasi 2 Polimerasi 3 Enzimi di modificazione 4 Topoisomerasi 5

17. Nucleasi Sono enzimi che tagliano, accorciano o degradano molecole di acidi nucleici, catalizzando l'idrolisi del legame fosfodiesterico. Ne esistono di due tipi: Esonucleasi 1 idrolizzano il DNA partendo dai nucleotidi situati alle estremità dei filamenti Endonucleasi tagliano direttamente all'interno del filamento 2

18. Ligasi Uniscono insiemi molecole di acidi nucleici a formarne una terza attraverso un nuovo legame chimico, spesso accompagnato dall'idrolisi di una molecola come ATP.

19. Polimerasi Producono copie di molecole. La maggior parte delle polimerasi può funzionare soltanto se lo stampo possiede una regione a doppio filamento che agisce da primer per l’inizio della polimerizzazione degli acidi nucleici, come DNA e RNA.

20. Enzimi di modificazione Rimuovono o aggiungono gruppi chimici modificando la struttura di molecole di DNA. I più importanti sono: Fosfatasi alcalina 1 Rimuove il gruppo fosfato presente al terminale 5’ Polinucleotide chinasi 2 Aggiunge il gruppo fosfato sul terminale 5’ Deossinucleotidil trasferasi terminale 3 Aggiunge dei deossiribonuclotidi al terminale 3’

21. Polimerasi Introducono o rimuovono superavvolgimenti da molecole di DNA circolare chiuso covalentemente

22. Enzimi che tagliano il DNA: ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE La clonazione dei geni richiede che le molecole di DNA siano tagliate in maniera precisa. Ogni molecola di vettore dev’essere tagliata in una singola posizione, per aprire il cerchio in modo da poter inserire nuovo DNA, ma spesso è anche necessario tagliare il DNA che dev’essere clonato. Per tagliare le molecole di DNA in maniera precisa e riproducibile vengono usate le endonucleasi di restrizione. Ne esistono di tre tipi e si distinguono per una modalità di azione leggermente diversa. Per la clonazione dei geni vengono usati soprattutto quelli di II tipo, perché ciascun enzima di questa classe possiede una sequenza di riconoscimento specifica a livello della quale taglia una molecola di DNA. Per determinare il numero e le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dal taglio bisogna effettuare l’analisi di restrizione, mentre per selezionare le corrette endonucleasi di restrizione per le particolari manipolazione di taglio si usa la mappa di restrizione.

23. Unione di molecole di DNA: LEGATURA Il passaggio finale della costruzione di una molecola di DNA ricombinante è l’unione della molecola del vettore con il DNA da clonare, Legatura, e l’enzima che catalizza la reazione è il DNA ligasi.

24. PURIFICAZIONE DI DNA

25. Preparazione di DNA cellulare totale • Il processo di preparazione di DNA completo avviene in 4 fasi: • Una coltura di batteri viene fatta crescere e quindi raccolta (grazie ai brodi di cultura, tipo agar, estratti di amminoacidi). Gli elementi sempre presenti nei brodi di cultura: • cloruro di sodio (perché è il sale) • solfato di magnesio • glucosio • Le cellule vengono aperte per provocare il rilascio del loro contenuto (vengono aperte con la soluzione ipertonica) • Questo estratto cellulare viene trattato per rimuovere i componenti tranne il DNA • La soluzione risultante di DNA viene concentrata (precipitazione in etanolo) • Un altro metodo per la preparazione del DNA è la centrifugazione per sedimentazione del dna (in fondo alla provetta perché è più pesante della soluzione).

26. Preparazione di DNA plasmidico Il procedimento di purificazione è lo stesso di quello del DNA cellulare totale. La preparazione di DNA plasmidico prevede la separazione di una piccola quantità di DNA circolare separandolo da quello genomico, molto più abbondante. Questo metodo di separazione avviene in base alle dimensioni e alla conformazione. Anche il DNA plasmidico può essere separato tramite centrifugazione e cromatografia.

27. Preparazione di DNA batteriofago

28. BIOTECNOLOGIE IN MEDICINA

29. Terapia Genica La terapia genica è l'inserzione di materiale genetico (DNA) all'interno delle cellule al fine di poter curare delle patologie. Questa procedura di inserzione è nota come transfezione. Esistono due tipologie di terapia genica: quella delle cellule germinali e quella delle cellule somatiche. • La prima si propone di trasfettare le cellule della linea germinale come spermatozoi ed ovociti o le cellule staminali totipotenti dei primissimi stadi dello sviluppo dell'embrione (allo stadio di 4-8 cellule), ma attualmente essa non viene messa in pratica sia per ragioni tecniche ma soprattutto per i grandissimi dilemmi etici cui si può andare incontro. • La seconda tipologia, invece, si propone di modificare solamente le cellule somatiche, senza intaccare, quindi, la linea germinale ed oggigiorno è la via più studiata e tentata. La terapia genica delle cellule somatiche, a sua volta, viene suddivisa in due gruppi: la terapia genica ex vivo e quella in vivo.

30. Quali sono le malattie genetiche che sono state studiate con il metodo delle sonde geniche/molecolari?

31. Fibrosi cistica, malattia polmonare • Corea Hungtinton, neuro-degenerazione • Distrofia muscolare • Anemia • Fenilctunuria (TKU), degenerazione che • provoca urine scure e si risolve il problema non • mangiando prodotti con la fenilalanina • Talassemia • Retinoblastoma • Tais Ax

32. Approfondimenti

33. BIOTECNOLOGIE & BIOETICA

34. L'OGM Gli organismi geneticamente modificati sono animali, piante o microrganismi il cui patrimonio genetico, o geoma, è stato modificato introducendo un gene preso da un altro organismo. Gli organismi geneticamente modificati vengono prodotti e studiati per migliorare alcune caratteristiche della produzione di beni agricoli e animali, per migliorarne alcune caratteristiche. In alcuni di essi sono stati prodotti per sopperire a carenze alimentari o per diffondere in maniera economica dei vaccini. il loro impiego dunque rappresenta un grande avanzamento tecnologico.

35. aumento delle coltivazioni ogm • Il seguente grafico illustra l’ aumento delle coltivazioni OGM nel corso degli anni.

36. che cos'è la biotecnologia e cosa c'entra con gli ogm? • la biotecnologia è un processo mediante il quale si sfruttano le caratteristiche di un organismo per ottenere un determinato effetto. • I vantaggi di queste tecniche sono evidenti a tutti, specialmente nel campo dell’agricoltura: si potrebbero ottenere piante in grado di resistere in particolari condizioni climatiche con grande risparmio denaro, tempo e aumento del rendimento. • Questo potrebbe significare la soluzione del problema della fame nei paesi sottosviluppati, inoltre in questo modo si potrebbe ridurre l’inquinamento da pesticidi o da fertilizzanti

37. i detrattori dell'ogm • I detrattori dell’OGM sottolineano invece come ogni variazione dell’ordine naturale potrebbe condurre a risultati catastrofici. Molti ancora sostengono che l’utilizzo di questi organismi, in quanto effetto di mutazioni genetiche, potrebbe portare a malattie che causano a loro volta mutazioni genetiche nell’organismo delicato di chi se ne ciba, come tumori infantili.

38. le biotecnologie • Con il termine biotecnologie si intendono quelle tecnologie che utilizzano organismi viventi o loro componenti per ottenere quantità commerciali di prodotti utili oppure per migliorare le caratteristiche di piante, animali o, ancora per sviluppare microrganismi utili per usi specifici. Le principali applicazioni delle biotecnologie si registrano nei settori: • Farmaceutici e di medicina, per la produzione di prodotti diagnostici e medicinali • Agricoltura veterinaria e zootecnia • Bioindustria, per la produzione industriale di vitamine, aminoacidi, enzimi e prodotti alimentari • Ambientale per lo smaltimento dei rifiuti, la depurazione delle acque del suolo e dell’ area

39. cos'è l'ingegneria genetica • L’ingegneria genetica permette di programmare i microrganismi e di assegnare loro nuove funzioni. • Partendo dalla copia della proteina umana che si intende produrre attraverso il batterio ricombinante inserito in una molecola di DNA si arriva all’estrazione delle proteine che i batteri hanno prodotto.

40. quando sono nate le biotecnologie tradizionali? • Le biotecnologie tradizionali, intese semplicemente come utilizzazione di organismi viventi, risalgono ai tempi preistorici; il latte che si trasforma in formaggio, il succo d’uva in vino, sono un esempio di biotecnologie tradizionali che si usavano già da tanti secoli.

41. quando sono nate le biotecnologie avanzate? • L’origine delle biotecnologie avanzate può essere fatta risalire al 1680 quando, Anton Von Leewenhoek riuscì per primo a vedere i batteri grazie alla costruzione di un microscopio. Successivamente gli scienzati Pasteur, Crick, Wotson e Berg grazie ai loro studi e alle loro scoperte posero le basi delle moderne biotecnologie avanzate. Il primo traguardo di questo progetto fu nel 1982 quando fu immesso sul mercato il primo biofarmaco (l’insulina) prodotta grazie all’ingegneria genetica.

42. i rischi delle biotecnologie • I rischi delle biotecnologie sono per l’opinione pubblica limitati all’uso delle piante modificate. Queste vengono consumate su larga scala da più di un decennio senza mai riportare complicazioni di nessun tipo. Anche l’Agenda 21 riconosce come le biotecnologie possono contribuire allo sviluppo internazionale solo se queste vengono sviluppate ed applicate adeguatamente.

43. Produzione di vaccini e di farmaci economici Possibilità di diagnosticare o curare malattie il cui gene sia conosciuto Possibilità di rilevare elementi patogeni negli alimenti Abbassamento dei costi di riproduzione di farmaci e vaccini con relativo aumento della produzione Aumento della quantità degli alimenti, miglioramento della qualità, della resistenza a stress ambientale, a parassiti e altri patogeni Biorisanamento del suolo e delle acque inquinate da composti tossici Possibilità di effettuare diagnostica ambientale. i vantaggi delle biotecnologie

44. le biotecnologie per l'ambiente • Le biotecnologie sono capaci di assicurare il corretto smaltimento dei rifiuti, l’ottenimento di prodotti puliti, la produzione di rifiuti ecocompatibili, la bonifica del suolo, acque e aria. Proprio nell’ultimo decennio per le biotecnologie definite ambientali si è venuta a creare una domanda di mercato di straordinarie dimensioni.

45. Biotecnologie nello smaltimento dei rifiuti Lo smaltimento dei rifiuti urbani, solidi e liquidi, oggi è un problema sociale. Le biotecnologie svolgono un ruolo molto importante perchè esaminano l’ intero ciclo di smaltimento e recupero dei rifiuti urbani. Al giorno d’ oggi la moltitudine di sostanze chimiche nocive, come i bio-gas da discarica, compost, bio-gas da digestione anaerobica e i rifiuti liquidi urbani e industriali provocano un ingente inquinamento atmosferico.

46. DNA Barcode • La tecnica più avanzata per classificare gli esseri viventi è detta PCR ed è frutto dello studio del DNA mitocondriale (mtDNA). La mirata analisi sul DNA mitocndriale è dovuta al fatto che esso è difficilmente modificabile; esistono inoltre dei vantaggi: • è di dimensioni ridotte • è trasmissibile per eredità materna • Un problema può essere costituito dalle mutazioni, a cui possono essere soggetti i geni depistando il riconoscimento della specie. Per fronteggiare il problema si preferisce utilizzare il gene CO1 presente nel mtDNa grazie al quale si posso distinguere specie diverse anche in individui apparentemente simili. • La tecnica del DNA Barcode viene utilizzato per stabilire la data di morte degli individui esaminando gli insetti presenti sul cadavere e anche nel sottore alimentare al fine di evitare frodi commerciali.

47. il codice a barra utilizzato per l'identificazione della specie • Come illustrato nella seguente immagine, si può osservare, come il codice a barra venga utilizzato per confrontare le sequenze che si ottengono in laboratorio, con quelle di migliaia di specie memorizzate in una banca dati pubblica.

48. Lavoro realizzato da: • Esposito Alessandra II E • Chinetti Simone II E • Manco Gennaro II E • Rubino Stefano II E

49. TOPITRANSGENICI C:\ Cinzia Buccella

50. Introduzione • Lo sviluppo delle tecnologie dell’ ingegneria genetica negli ultimi venti anni ha permesso di mettere a punto metodologie per modificare geneticamente gli animali. • Questo può essere fatto in modi differenti per ottenere risultati diversi: -A livello locale, nel topo adulto, si utilizzano particolari strategie (vettori virali e DNA nudo) che permettono di modificare le cellule di un determinato tessuto,con un efficienza molto variabile a seconda del tipo di tessuto,del gene e del vettore. -Nell’ interno dell’ animale agendo sulle cellule staminali-embrionali o sullo zigote(cellula risultante dalla fecondazione della cellula uovo con lo spermatozoo).