1 / 45

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I.

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest.

livvy
Download Presentation

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

  2. KÉMIAI TUDOMÁNYOKSZERVETLEN – SZERVESKLASSZIKUS SZERVETLEN ÉS SZERVES ANALITIKAI KÉMIABIOLÓGIA – BIOMOLEKULÁRIS KÉMIABIOANALITIKAELVÁLASZTÁSTECHNIKÁKELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY

  3. Paradigma váltás aBIOANALITIKÁBANPROTEOME(Wasinger et al. 1995)„protein equivalent of a genom”„protein complement encoded by a given genom”PROTEOMICS - GENOMICS

  4. PROTEOMICS(Wang és Hanasch, 2003)EXPRESSION PROTEOMICSA genomban kódolt valamennyi fehérje azonosítása és mérése, Celluláris lokalizációjuk és poszt-transzlációs módosításuk meghatározása.FUNCTIONAL PROTEOMICSA FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSAINAK VIZSGÁLATAAZ INDIVIDUÁLIS FEHÉRJÉK SZEREPÉNEK MEGHATÁROZÁSA A SPECIFIKUS ANYAGCSERE FOLYAMATOKBAN ÉS CELLULÁRIS STRUKTÚRÁKBAN A FEHÉRJÉK SZERKEZETÉNEK ÉS FUNKCIÓJÁNAK FELDERÍTÉSE

  5. FUNKCIONÁLIS PROTEOMIKA BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOPOLIMEREK MOLEKULA SZERKEZETÉNEK KUTATÁSA  ANOMÁLIS MOLEKULASZERKEZETEK KIMUTATÁSA  A FEHÉRJÉK POSZTTRANSZLÁCIÓS FOLYAMATAINAK ÉS MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA(GLIKOZILÁLÁS) GYAKORLATI CÉLOK – ALKALMAZOTT KUTATÁS DIAGNOSZTIKA - PROGNOSZTIKA - MARKEREK (PL. DAGANATOS MEGBETEGEDÉSEK FELISMERÉSE)

  6. ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY ELVÁLASZTÁSI FELADATOK MINTA ELŐKÉSZITÉS ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYIDEJÜ ÉS ÖSSZEHANGOLT ALKALMAZÁS MULTIMODÁLIS – MULTIDIMENZIONÁLIS ANALITIKAI – PREPARATIV

  7. AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI RENDSZER

  8. ANALITICA EST ANCILLA CHEMIAE ? Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN

  9. MINTA ELŐKÉSZITÉS ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK ÉS KÖVETELMÉNYEK A MINTA JELLEMZÉSE A VIZSGÁLANDÓVEGYÜLET(EK) TULAJDONSÁGAINAK ISMERETE MOLEKULATÖMEG, ALAK, MINŐSÉG (Globuláris-fibrilláris, aggregáció, flexibilitás, belső viszkozitás), SZERKEZET, FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK, OLDÉKONYSÁG, SZOLVATÁCIÓ-HIDRATÁCIÓ,POLARITÁS, pKA, pKI HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐK(Diffúziós állandó, Stokes-rádiusz), SPEKTROSZKÓPIAI ADATOK, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS (Enzimatikus, élettani, stb.) STABILITÁS (Fény, Hő, Idő) ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK (pI) IRODALMI ADATOK HASONLÓ SZERKEZETÜ ANYAGOKRA(ADATBÁZIS)

  10. MINTA ELŐKÉSZITÉS A BIOLÓGIAI KÖRNYEZET (MATRIX) JELLEGE Kinyerhető-e a vizsgálandó anyag a változatlan mátrixból, Felszabadítható-e a szilárd fázisból, Csökkenthető-e a mátrix kötésének erőssége, (pl. higítás, pH, ionerősség, stb. változtatásával) Vannak-e jelen potenciális interferáló vegyületek. AZ INTERFERÁLÓ ANYAGOK VIZSGÁLATA A minta jellemzéséhez hasonlóan.

  11. MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZÍTÉS IGÉNYEI CLEAN UP - SELECTIVE ENRICHMENT TISZTITÁS IGÉNYE felmerül-e ? (Specifikus detektálhatóság, interferáló anyagok?) TÖMÉNYITÉS IGÉNYE felmerül-e ? (Oldékonyság, detektálhatóság, ?) OLDÓSZER CSERE (váltás) igénye felmerül-e ? - Alkalmas-e az eluáló oldószer(elegy) a HPLC-re ? - Alkalmas-e a vizes elúció a detektálásnál ? - Szükséges-e más (illékony) oldószer alkalmazása ?

  12. MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI FIZIKAI-MECHANIKAI MÜVELETEK MINTAVÉTEL (Random, statisztikai, anatómiai heterogenitás, stb.) APRITÁS, ÖRLÉS, HOMOGENIZÁLÁS (Késes, Grinder, Potter, Dounce, Ultrahang) SZITÁLÁS, SZÜRÉS, ULTRASZÜRÉS, DIALIZIS CENTRIFUGÁLÁS - ULTRACENTRIFUGÁLÁS KIVONÁS (EXTRAKCIÓ), TÖMÉNYITÉS, SZÁRITÁS

  13. MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI KÉMIAI MÜVELETEK HIGITÁS, IONERŐSSÉG, pH VÁLTOZTATÁS HIDROLIZIS (Savas, lúgos, enzimatikus) SZÁRMAZÉK KÉPZÉS (Kromofor csoportok, polaritás változtatás, stb.) ADALÉKANYAGOK (Ion-pár képzés, detergensek, polaritás változtatás) SPECIÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK (Immuno-affinitás, zárvány-fém komplex)

  14. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN Elektroforézis - Elektromigráció ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK GRAVITÁCIÓS ERŐTÉRBEN Centrifugálás – Ultracentrifugálás

  15. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK SZITÁLÁS, SZŰRÉS,ULTRA(MOLEKULA)SZŰRÉS, DIALIZIS SZÁRÍTÁS (BEPÁRLÁS, VÁKUUM BEPÁRLÁS, FAGYASZTVA SZÁRÍTÁS) SZÉTKRISTÁLYOSÍTÁS (pl. diasztereomer sópárok) KIVONÁS – EXTRAKCIÓ GÁZ-GŐZ FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Vákuum, vagy vízgőz desztilláció, Gőztér (head space) analizis, Vivőgázzal (N2Ar, He), Kriocsapdával(purge and trap) FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ SZUPERKRITIKUS ÁLLAPOTÚ (CO2, CS2) EXTRAKCIÓ

  16. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS KIVONÁS – EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Megoszlási egyensúly létrehozása nem elegyedő oldószer (vizes!) fázisok között Szakaszos (pl. kirázás választótölcsérben), Folyamatos (ellenáramú, counter current) technikák FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Oldószeres, sós, savas kicsapás (precipitáció) Szilárd fázisból történő extrakció Soxhlet eljárás, Szilárd fázison történő extrakció SPE (Solid Phase Extraction)

  17. AZ FOLYAMATOS ELLENÁRAMÚ FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Countercurrent Flow-Through Coil Centrifuge (Ito et al. 1971)

  18. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ OLDÓSZERES, SÓS, SAVAS KICSAPÁS (PRECIPITÁCIÓ – BIOLÓGIAI MINTÁK) MeOH, CHCl3-MeOH, CH3CN, PrOH, Aceton, Éter EtOH (Cohn-féle frakcionálás), hődenaturáció (NH4)2SO4, Na2SO4, PEG, kaprilsav, Rivanol, stb. Triklór ecetsav, perklórsav, foszforwolframsav, szulfoszalicilsav,

  19. SOXHLET KÉSZÜLÉK ELLENÁRAMÚ EXTRAKCIÓ

  20. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)

  21. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁLLÓFÁZIS KIVÁLASZTÁSA (TÖLTET, CARTRIDGE) A MINTA KÖLCSÖNHATÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ? („C” - SiO2 - Al2O3 – CN – OH – NH – IEX – RP 2-18 – HIC – SEC – AFF ) RETENCIÓS ADATOK (HPLC)? SZELEKTIVITÁS AZ ÁLLÓ FÁZISRA? ÁLLÓ FÁZIS HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐI (SZEMCSE MÉRET, ELOSZLÁS, ALAK, TÖLTÉS MINŐSÉGE) TÖLTET REPRODUKÁLHATÓSÁGA (BATCH TO BATCH)

  22. SZERVES MINTA (MW<2000Da) OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN /|\/\ POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS IONOS NEM IONOS (ION-PÁR) MeOH Hexán KATIONOS ANIONOS POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS CH3CN Heptán EtAc CHCl3 NPC ADS RPC IEX NPC ADS RPC CIANO KIESELGUHR C18 CIANO AMINO CIANO SíOH C18 KIESELGEL DIOL SiOH C8 -COOH NH2/NH DIOL FLORISIL C8 AMINO FLORISIL CIKLO -SO3H -NR3+ -NH2/NH Al2O3 CIKLO HEXIL HEXIL -NH2/NH Al2O3 FENIL - CN FENIL - CN

  23. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁRAMLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (MINTA OLDÓSZERE, MOSÓFOLYADÉK, ELUENS) A MINTA ÖSSZETEVŐINEK OLDÉKONYSÁGA KÖLCSÖNHATÁSOK LÉTREHOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ÉS/VAGY MEGBONTÁSA DIFFERENCIÁLÁS LEHETŐSÉGE (OLDÓSZER ELEGYEK)

  24. SZERVES MINTA (MW>2000Da) OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN /\ IONOS NEM-IONOS /\ Ion-pár képző KATIONOS ANIONOS RPC WP-BUTIL (C4) IEX SEC IEX WP-BUTIL (C4) SEC WP-COOH WP-PEI Sephadex G-25 Sephadex G-25 HEXÁN HEXÁN PUFFER METILÉN KLORID VIZES PUFFEREK METILÉN KLORID ACETONITRIL ACETONITRIL ACETON ACETON METANOL – VIZ METANOL - VIZ

  25. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) A SPE ALKALMAZHATÓSÁGÁNAK ÁLTALÁNOS SZABÁLYA AZ ÁLLÓ FÁZIS ERŐSEN POLÁRIS GYENGÉN POLÁRIS-APOLÁRIS SiO2C18 A MINTA OLDÓSZERE GYENGÉN POLÁRIS ERŐSEN POLÁRIS (MOSÓFOLYADÉK) (HEXÁN, THF) (H2O, AcOH, TFA) AZ ELUÁLÓ ERŐSEN POLÁRIS APOLÁRIS OLDÓSZER (VIZES PUFFER, AcOH, MeOH) (MeOH, ACN) A MINTA ELŐSZÖR A ÖSSZETEVŐINEK LEGAPOLÁRISABBLEGPOLÁRISABB LEOLDÓDÁSI ÖSSZETEVŐK SORRENDJE OLDÓDNAK LE

  26. Minta előkészítés Extrelut NT-vel • 3. Szerves oldószer felvitele • (vízzel nem elegyedő) 1. Extrelut® NT 2. Vizes alapú minta felvitele • 4. Elúció • Lipofil komponensek kinyerése a mintából

  27. LiChrospher® ADSAlkyl Diol Silica • LC-integrált (on-line) mintaelőkészítéshez • Kettős módosítással készült szilika részecskék (25 µm): • Hidrofil külső felület DIOL módosítással • biokompatibilis diol borítás • elkerülhető a proteinek/nukleinsavak irreverzibilis adszorpciója a szilika részecskék felületén • nincs oszlop eltömődés • nem növekszik a nyomás Hidrofób belső felület: pórusfalak fordított fázisú módosítással (RP- 4, RP- 8 ill. RP-18) • a retenciós tulajdonságok az analit polaritásához igazíthatók • a pórusok csak kis méretű analitok számára hozzáférhetők (MW < 15,000 Dalton) • nagyobb makromolekulák (pl. proteinek, nukleinsavak) a pórusokon kívül maradnak és kvantitatívan eltávolíthatók

  28. Makromolekuláris összetevők (protein, nukleinsav) Diol felületi réteg Kismolekulájú apoláris összetevők Apoláris belső szerkezet LiChrospher  ADS

  29. Többrétegű héjszerkezetű kromatográfiás állófázis (C18) vázlatos szerkezete és pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

  30. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER ELŐZETES VIZSGÁLATA SORÁN MEG KELL HATÁROZNI AZ EXTRAKCIÓ OPTIMÁLIS MÓDJÁT, A MÁTRIX MÓDOSÍTÁSÁNAK LEHETŐSÉGÉT, A MEGFELELŐNEK TARTOTT ÁLLÓ FÁZIST (TÖLTET, SZORBENS), A MEGFELELŐNEK TARTOTT OLDÓSZERELEGYEKET (MOSÓ-ELUÁLÓ), A MINTA (MINIMÁLIS-SZÜKSÉGES) TÉRFOGATÁT, AZ ÁLLÓ FÁZIS MÉRETÉT (ÁTTÖRÉSI TÉRFOGAT-MENNYISÉG)

  31. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER OPTIMÁLÁSA REPRODUKÁLHATÓSÁG, VISSZANYERÉS REFERENCIA VEGYÜLETEKKEL, HATÁSOSSÁG MATRIX NÉLKÜL ÉS KOMPLEX (BIOLÓGIAI) RENDSZERBEN, INTERFERÁLÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK MODELLEZÉSE, VALIDÁLÁS BELSŐ ÉS KÜLSŐ STANDARDOKKAL (ROBOSZTUSSÁG) HIBA, SZÓRÁS, ÉRZÉKENYSÉG, KIMUTATHATÓSÁGI HATÁR, SPECIFICITÁS MEGHATÁROZÁSA, KÖLTSÉGKIHATÁS, GAZDASÁGOSSÁG BECSLÉSE.

  32. A FOLCH-FÉLE EXTRAKCIÓ Apoláris (lipidek-zsírok) vegyületekre VIZES FÁZISÚ MINTA 1 TÉRFOGAT (VÉRSZÉRUM, SZÖVET HOMOGENIZÁTUM) KLOROFORM-METANOL (1:1) 16 FORRÁSIG HEVÍTÉS KLOROFORM 8 SZŰRÉS – CENTRIFUGÁLÁS VÁLASZTÓTÖLCSÉRBEN 1% KCl 0,2 TÉRFOGAT ELVÁLASZTÁS KLOROFORM (ALSÓ) FÁZIS BEPÁRLÁSA ANALIZIS (TLC, HPLC) VIZES MeOH CHCl3

  33. POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS 1. - LÉPÉSBEN: CHCl3-MeOH-AcOH (35-25-4) 2. - LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-AcOH (85-15-3) ELŐHIVÁS: PMS

  34. MINTAELŐKÉSZÍTÉS – SPE TERMÉSZETES POLI (OLIGO) AMINOK MEGHATÁROZÁSA Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok Homogenizálás foszfát pufferben, pH 7,2 Kicsapás 7% -os HCIO4 Centrifugálás → felülúszó Tisztítás és előfrakcionálás DOWEX 50X-8 • Danzilezés ( 60’ - 540C) • Aceton elpárologtatása • Extrakció toluollal • Szárazra párlás, • Oldás metanolban • HPLC

  35. A t-RNS SZERKEZETE PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

  36. MINTA ELŐKÉSZÍTÉS – SPE NUKLEOZIDOK (Ade, Cyt, Gua, Uri, Ψ-Uri) ELVÁLASZTÁSA BORONÁT AFFINITÁSI FÁZISON 0,1M HCOOH NH4Ac puffer pH:8,8 HPLC

  37. MINTAELŐKÉSZÍTÉS - SPE HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) IZOLÁLÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HUMÁNSZÉRUM ▼ NEM ELEGYEDŐ FÁZISÚ OLDÓSZERES EXTRAKCIÓ KLOROFORM-METANOL-VÍZ CENTRIFUGÁLÁS ▼ VIZES-METANOLOS FÁZISBÓL FEHÉRJÉK KICSAPÁSA ETANOLLAL CENTRIFUGÁLÁS ▼ FESTÉK-LIGAND (Cibacron Blue) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

More Related