Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu

1. Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche IX ciclo Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu Tutor: Prof. Liberato Marzullo Dottorando: Sandro Montefusco 26/01/2012

2. Introduzione: • Famiglia dei Trefoil Factors • Costituita da: peptide gastrico pS2/TFF1, peptide spasmolitico SP/TFF2 e fattore intestinale ITF/TFF3 • Struttura • - Motivo caratterizzato da tre anse e stabilizzato da tre ponti disolfuro • Funzione • Ruolo essenziale nei processi di restituzione e rigenerazione epiteliale nel tratto GI • Coinvolgimento in cruciali processi fisio-patologici: insorgenza e sviluppo neoplastico, proliferazione, differenziamento, migrazione cellulare, apoptosi

3. Introduzione: Siti di espressione: TFF1: stomaco, duodeno, colon, pancreas, ghiandole di Brunner, vescica, ghiandole salivari e lacrimali, epitelio respiratorio, ghiandole mammarie, dotti biliari. TFF2: stomaco, ghiandole di Brunner, epitelio del dotto pancreatico e biliare. TFF3: epitelio intestinale, cellule goblet, ghiandole Brunner, utero, mammella, ipotalamo, ipofisi. Hypothalamus – Hypophysis Lacrimal Glands Bladder

4. Introduzione: Infiammazione Ulcere intestinali, soggetti affetti dal morbo di Crohn e infezioni da H. pylori presentano, nelle aree compromesse, elevati livelli di TFF1 Variazioni dei livelli dei peptidi TFF sembrano essere coinvolte nei processi neoplastici Tumor-suppressor TFF1 ridotto in metaplasie intestinali e adenomi gastrici, TFF1 completamente assente nel 40-60% di carcinomi gastrici Topi tff1knockout sviluppano adenoma gastrico e carcinoma intramucosale Carcinoma della mammella TFF1 indotto da estrogeni TFF1 marker tumorale

5. Real Time tff1 L’analisi effettuata su intestino di ratti, resi nutrizionalmente carenti di rame, ha mostrato aumento dell’espressione del peptide TFF1. TFF1 lega specificamente il rame. L’interazione induce un cambio di conformazione nella struttura terziaria della proteina. Trefoil Factor 1

6. Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. • Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

7. Espressione di TFF1 in cellule AGS Real Time PCR ** p value = 0,08 * p value < 0,05 L’espressione di TFF1 aumenta in condizioni di depletamento di rame

8. Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi

9. Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi controllo -435 BCS anova p<0,05 Nella regione -583/-435 esistono elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo che regolano positivamente l’espressione del gene in condizioni di deprivazione di rame

10. Analisi del promotore L’analisi della sequenza -583/-435 con il software Transfac ha mostrato la presenza di un sito putativo Sp1 tra le sequenze consensus con score più elevato

11. Analisi del promotore p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled sonda: p Sp1 sonda: c Sp1

12. Analisi del promotore p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled sonda: p Sp1 sonda: c Sp1 Le proteine degli estratti nucleari legano in modo specifico la sequenza putativa di legame ad Sp1

13. Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. • Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

14. Western Blot: surnatanti di cellule AGS-AC1 TFF1 dimero TFF1 condizioni riducenti condizioni non riducenti Rame e forma omodimerica di TFF1 Il rame promuove la formazione dell’omodimero

15. Migrazione Cellulare: Wound Healing AGS-AC1

16. BCS + dox - dox * + dox - dox distance (m) * p-value < 0,05 AGS-AC1 TFF1 L’induzione di TFF1 determina un aumento della migrazione cellulare La chelazione di Cu modula negativamente l’attività motogenica di TFF1 Migrazione Cellulare: Wound Healing 24 h distanza (µm) (Tosco A, Monti MC, Fontanella B, Montefusco S, D'Andrea L, Ziaco B, Baldantoni D, Rio MC, Marzullo L., Cell Mol Life Sci. 2010) * p-value < 0,05

17. Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. • Studiare l’influenza del rame nella formazione dell’omodimero di TFF1 e sulla sua attività motogenica. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

18. r TFF1 controllo Cu 10 μM Cu 100 μM Controllo Cu 10 M Cu 100 M Rame e secrezione di TFF1 in AGS-AC1 72 h In cellule incubate in eccesso di rame, si osserva un ritardo nella secrezione della proteina

19. AGS-AC1 TFF1 e omeostasi del rame +/+ -/- Fegato Stomaco Intestino KO tff1

20. TFF1 e omeostasi del rame Cellule iper-esprimenti TFF1 accumulano quantità maggiori di rame 24 h -S +/- dox 0 20 80 300 AGS-AC1 Cu 10 M

21. TFF1 e omeostasi del rame 24 h -S Cu 10 M +/- dox Cellule iper-esprimenti TFF1 trattengono il rame per tempi più lunghi 0 20 80 120 300 600 AGS-AC1 BCS 500 M

22. TFF1 e omeostasi del rame Bassi livelli di rame Alti livelli di rame TFF1 Cu2+

23. Obiettivi: - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. • Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

24. Helicobacter pylori: interazione con TFF1 H. pylori interagisce con TFF1 Ipotesi per l’infezione tessuto- specifica caratteristica del batterio La porzione oligosaccaridica degli LPS di H. pylori legano TFF1 nella forma dimerica Il pH ottimale di questa interazione è tra 5.0 - 6.0

25. Helicobacter pylori: introduzione 1892 - Il medico italiano Giulio Bizzozero descrisse per la prima volta batteri spiraliformi nello stomaco di animali. 1893, Arch Mickrobiol Anat 1984 - Due ricercatori australiani, Marshall e Warren, descrissero per la prima volta una relazione tra strani bacilli ricurvi, dapprima classificati entro il genere Campylobacter, con forme di gastrite attiva e ulcere duodenali 1984, Lancet; 8390:1311-5 1989 - Classificazione del genere Helicobacter Goodwin et al 1989, int j syst bacteriol, 39:397 2005 - I due ricercatori australiani ricevono il Nobel per la medicina

26. Helicobacter pylori: introduzione • Gram Negativo • Dimensioni: 0,5-1 m x 2-4 m • Microaerofilo: 37°C 3-5 giorni • Mobile per la presenza di 4-6 flagelli • Genoma: 1,4 - 1,7 Mb • Patogeno per l’uomo • Ureasi positivo • Trasmissione: orale-orale / fecale-orale / gastro-orale • Epidemiologia: endemica • adulti bambini • >50 anni 2-10 anni • paesi industrializzati 35-40% 5-10% • paesi in via di sviluppo 80-90% 45-50%

27. Cag Island Suerbaum S. & Josenhans C., Nature 2007 Effects of VacA Cover T.L.. & Blanke S.R.., Nature 2005 Helicobacter pylori: fattori di virulenza Cag island:locus ~ 40 kb, 31 geni. Molti di questi geni codificano per il sistema di secrezione di tipo IV. CagA:proteina batterica che transloca nella cellula ospite promuovendo cambiamenti morfologici e alterazioni della membrana plasmatica. VacA: altera la permeabilità della membrana mitocondriale promuovendo l’apoptosi; stimola segnali pro-infiammatori; altera il normale traffico delle vescicole del compartimento endosomiale provocando la formazione di canale e formazioni di vacuoli. BabA2: lega l’antigene Lewis(b) delle cellule epiteliali gastriche.

28. Helicobacter pylori: LPS • Bassa immunogenicità degli LPS di H. pylori • Particolari variazioni nella componente “Lipide A” • Infezioni a lungo termine • Infiammazione cronica promuove un danno gastrico

29. Helicobacter pylori: LPS LPS Frazioni Subcellulari Lisati Cellulari

30. Cu 10 µM BCS 500 µM Dox Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Effetti dei trattamenti sulla vitalità di H. pylori

31. Helicobacter pylori: Infezione di H. pylori in AGS-AC1 AGS-AC1 rosso - H. pylori verde - TFF1 blu - nuclei Controllo + Dox CagA 130 kDa

32. Hp Hp BCS - + - + Dox - - + + Cu - + - + Dox - - + + Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo H. pylori P12 wild-type Cu 10 M BCS 500 M T-test : p-value **< 0,01 * <0,05 TFF1 svolge un ruolo significativo nelle infezioni di H. pylori Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1

33. Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Wt P12 Il ceppo mutato P12HP∆1191 non interagisce con TFF1 P12HP479 P12HP1191 (Dolan B. et al., dati confidenziali, in stampa) HP479 codifica una D-glycero-D-manno-heptosyltrasferase HP1191 codifica una LD heptosyltransferase

34. Cu - - + Dox - + + BCS - - + Dox - + + Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo mutato HP479 Cu 10 M BCS 500 M T-test : p-value **< 0,01 * <0,05

35. Cu - - + Dox - + + control Dox Dox Cu Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo mutato HP1191

36. Helicobacter pylori: interazione con TFF1 HT29 MTX E12 (E12): Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso. (Alemka A., et al., Infect Immun. 2010) TFF1 e H. pylori colocalizzano nello strato mucoso (Dolan et al., dati confidenziali, in stampa)

37. Helicobacter pylori: interazione con TFF1 Infezioni in HT-29 E12 con ceppo H. pylori P12 wild-type Cu 10 M BCS 500 M T-test : p-value * <0,05

38. (Alemka A., et al., Infect Immun. 2010) Rame e strato mucoso HT29 MTX E12 (E12): Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso.

39. controllo B A C D E F Rame e strato mucoso

40. controllo Cu Rame e strato mucoso

41. Risultati • Il rame influenza l’espressione della proteina. Nel promotore di tff1 sono presenti elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo. • Il rame favorisce l’omodimerizzazione di TFF1 e la sua attività motogenica. • TFF1, nel modello cellulare AGS-AC1, è coinvolto nei processi di assorbimento/secrezione del metallo. • TFF1 favorisce l’infezione di H. pylori. Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1.

42. Prospettive future • Verificare l’effettivo legame di Sp1 sul promotore di TFF1. • Approfondire il coinvolgimento di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. • Individuare la regione di TFF1 coinvolta nel legame con i LPS di H. pylori.

43. Ringraziamenti Università di Salerno Dipartimento Scienze Farmaceutiche e Biomediche Dr. Marguerite Clyne University College Dublin School of Medicine & Medical Science Prof. Liberato Marzullo Prof. Alessandra Tosco Dr. Bianca Fontanella Dr. Roberta Esposito Dr. M.-C. Rio Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology - CNRS. Strasbourg, France Dr. D. Baldantoni Dipartimento di Chimica - Università di Salerno Coordinatrice del Dottorato Prof. Antonella Leone Considero valore sapere in una stanza dov’è il nord, qual è il nome del vento che sta asciugando il bucato. E. de Luca