Introduzione

1. Valutazione della sensibilità in vitro agli antimicrobici, ricerca dei fattori di virulenza e di geni responsabili dell’antibiotico-resistenza in Escherichia coli enteropatogeni isolati da coniglio Anna Giannina Perugini1, Anna Cerrone1, Fabrizio Agnoletti2, Lorella Barca1, Elena Mazzolini3, Giovanni Cattoli4, Vincenzo Caligiuri1, Mario Bartoli1, Federico Capuano1 1Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Via Salute 2, 80055 Portici (Na) 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Treviso, Viale Brigata Treviso 13/A, 31100 Treviso, 3Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Udine, Via Della Roggia 100, 33030 Campoformido (UD) 4Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Virologia, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro (PD) Introduzione Le infezioni da Escherichia coli enteropatogeni (EPEC) rappresentano una frequente causa di patologie gastro-intestinali nel coniglio. Tali patogeni sono in grado di indurre non solo specifiche lesioni intestinali, definite “attachment-and-effacement (A/E) lesion”, ma producono anche un caratteristico pattern di aderenza, definito ‘localized adherence’ (LA) (Adu-Bobie et al., 1998). Geni responsabili di LA e A/E sono stati localizzati in due regioni, definite ‘LEE region’ e EAF, all’interno delle quali, oltre a geni codificanti per sistemi di secrezione, è localizzato il gene dell’intimina (eae in LEE). A promuovere l’adesione alle cellule epiteliali intestinali del coniglio intervengono anche le fimbrie AF/R1 e AF/R2, descritte rispettivamente nel ceppo RDEC-1 (O’Hanley e Cantey, 1978) e negli isolati O103:H2 che non fermentano il ramnosio (Milon et al, 1990). Nonostante sia noto il meccanismo responsabile della patogenicità degli EPEC nel coniglio, i trattamenti per le enterocoliti da Escherichia risultano spesso inutili forse anche a causa della resistenza agli antimicrobici, in grado di favorire la sopravvivenza nonché la proliferazione di tali patogeni. In questo studio per la prima volta ceppi REPEC (Rabbit Enterophatogenic Escherichia coli), caratterizzati per la presenza dei geni di patogenicità eae, AF/R1 o AF/R2, sono stati analizzati sia per la sensibilità in vitro ad alcuni antimicrobici, comunemente usati in medicina veterinaria, in particolar modo nell’allevamento del coniglio da carne, sia per la presenza di alcuni dei determinanti genetici di resistenza agli antibatterici potenzialmente trasferibili ad altri patogeni. Risultati Dei 198 ceppi analizzati per la presenza dei fattori di virulenza, 129 sono risultati positivi per eae (65.2%), 114 per AF/R2 (57.6%), 15 per AF/R1 (7.6%), questi ultimi isolati tutti dallo stesso allevamento. I risultati dei saggi di sensibilità agli antibiotici e delle PCR per la ricerca di geni associati alla resistenza ai farmaci sono schematizzati nelle tabelle 1 e 2. Materiale e metodi Isolamento 198 ceppi di Escherichiacoli sono stati isolati da conigli deceduti per enterocolite in Italia. I campioni, raccolti durante gli esami necroscopici, sono stati isolati su McConkey agar, incubato a 37° C per 24h. La caratterizzazione biochimica delle colonie identificate è stata realizzata mediante gallerie API 20E System (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France). Sensibilità agli antibiotici I saggi di sensibilità sono stati eseguiti mediante la tecnica di diffusione in agar (Bauer, 1996), secondo le procedure della NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards (NCCLS). PCR La reazione a catena della polimerasi è stata utilizzata sia per la ricerca di alcuni fattori di patogenicità (eae; AF/R1 o AF/R2) ( Karch et al., 1993;Penteado et al., 2002) che di alcuni dei geni responsabili della resistenza: ai sulfamidici (sul1 e sul2) (Enne et al, 2001), al trimetoprim (dhfrI, dhfrV, dhfrVII, dhfrIX, dhfrXIII), alla gentamicina [aadB, aaC2, aac(3)-IV], alla neomicina (aphA1, aphA2 e aadB) e all’apramicina [aac(3)-IV] (Maynard et al., 2003). Tab. n° 1 Tab. n° 2 Conclusioni Sebbene sia stata analizzato solo un ridotto gruppo di geni associati alla resistenza ad alcuni antimicrobici, risulta evidente la presenza di alcuni di essi negli isolati analizzati. L’esistenza di geni in grado di garantire la resistenza a più farmaci, ovvero in grado di agire su molecole diverse [es. aac (3)-IV], può influenzare la “precocità” della comparsa dei fenomeni di resistenza, e incidere negativamente sull’efficacia delle eventuali associazioni impiegate in campo. Sebbene alcuni ceppi risultino sensibili ad alcuni farmaci, non presentano necessariamente i markers cercati (ad es. aadB), probabilmente perché sebbene conferiscano resistenza a più molecole della stessa famiglia (neomicina e gentamicina), sono solo una piccola rappresentanza del cluster di determinanti genetici in grado di conferire resistenza a diversi amminoglicosidi. I risultati ottenuti suggeriscono di estendere l’analisi dei geni di resistenza agli antimicrobici, ovvero di continuare il monitoraggio dei REPEC, non solo in funzione della loro nota patogenicità, ma anche in quanto potenziale serbatoio di geni di resistenza trasferibili ad altri organismi della microflora intestinale del coniglio. Bibliografia Adu-Bobie J, Frankel g, Bain C, Goncalves AG, Tabulsi LR, Douce G, Knutton S and Dougan G, 1998. J. Clin Microbiol, 36 (3): 662-668. Bauer Enne V.I., Livermore D.M., Stephens P., Hall L.M.C., 2001. The Lancet, 357: 1325-1328.Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S and HeesemannJ., 1993. J. Clin. Microbiol., 31: 1201-1205; O’Hanley P, Cantey JR, 1978.Infect Immun, 21: 874-878. MilonA, Esslinger L, Camguilhem R, 1990. Infect Immun 58: 2690-2695. National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1999. Approved standards M7-A5: methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. NCCLS, Wayne, Pa.