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Aktuelle Aspekte der Zöliakie

Aktuelle Aspekte der Zöliakie. Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Lichtenbergstr. 4, 85748 Garching in Zusammenarbeit mit der. Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und -toxizität und den Partnern des BMBF-Leitprojekts „Zöliakie“. Definition.

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Aktuelle Aspekte der Zöliakie

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  1. Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstaltfür LebensmittelchemieLichtenbergstr. 4, 85748 Garching in Zusammenarbeit mit der Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und -toxizität und den Partnern des BMBF-Leitprojekts „Zöliakie“ 1

  2. Definition Zöliakie = Einheimische Sprue = Glutensensitive Enteropathie: Lebenslange Intoleranz gegenüber Speicherproteinen (Gluten) aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (?), die mit einer schweren Schädigung der Dünndarmschleimhaut (Zottenatrophie) einhergeht und zur Malabsorption von essentiellen Nährstoffen führt Darmzotten normal zöliakiegeschädigt 2

  3. Symptome/Therapie Therapie Lebenslange strikte „glutenfreie Diät“= keine Produkte aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer außer reiner Stärke(Tägliche Aufnahme von Gluten < 20 mg) 3

  4. Chronik der Zöliakie 200 a.d. Patienten mit chronischem Durchfall = „koiliakos“ Beschreibung der Zöliakie, Behandlung durch Diät 1888 Toxische Wirkung von „Gluten“  „glutenfreie Diät“ 1950 Peptisch-tryptisches Glutenhydrolysat = toxisch 1959 Zöliakie und Einheimische Sprue = identische Krankheit 1960 Diagnose durch Dünndarmbiopsie 1961 Toxizitätsprüfung von Proteinen (in-vivo, in-vitro) 1970/71 Strukturaufklärung toxischer Peptide 1984/88 Gewebetransglutaminase = Autoantigen 1997 4

  5. Diagnose Empfehlungen der ESPGAN 1970 1990 Symptome Symptome 1. Biopsie  Atrophie 1. Biopsie  Atrophie IgA anti-Gliadin + IgA anti-TG + glutenfreie Kost glutenfreie Kost 2. Biopsie  Regeneration keine Beschwerden glutenhaltige Kost Diagnose „Zöliakie“ 3. Biopsie  Atrophie Diagnose „Zöliakie“ 5

  6. Aktuelle Aspekte • Häufigkeit • Antigen „Gluten“ • Autoantigen „Transglutaminase“ • Mechanismus • Analytik • Toxische Strukturen 6

  7. Häufigkeit Eisberg-Modell nach Logan (1991) 1 : 200 1) Diagnostizierte Zöliakie 2) Nicht-diagnostizierte Zöliakie (flache Mukosa) 3) „Latente“ Zöliakie (normale Mukosa, erhöhte Ig-Werte) Familien = 1 : 10, weiblich: männlich = 2:1 Genetische Disposition (HLA-DQ2) = 1 : 5 7

  8. Klassifizierung der Getreidemehlproteine Weizenprolamine = GLIADINE Weizengluteline = GLUTENINE Gliadine + Glutenine = GLUTEN (Kleber) 8

  9. Aminosäurezusammensetzung der Prolamine mol-% (Ausschnitt) (Wieser et al., 1980) 9

  10. Homologe Gruppen der Speicherproteine HMW = hochmolekular (P) = ProlamineMMW = mittelmolekular (G) = GlutelineLMW = niedermolekular 10

  11. 2-Dimensionales Modell eines -Gliadins (Müller, Wieser 1997) 11

  12. Toxizität der Kleberproteine -/+ 12

  13. Toxizität von Hafer Bis 1995 umstritten 13

  14. Autoantigen Gewebetransglutaminase (tTG) tTG 1) R-CO-NH2 + H2N-tTG  R-CO-NH-tTG + NH3 tTG 2) R-CO-NH2 + H2O  R-CO-OH + NH3 LQLQPFPQLPY H2N-tTG LQLQPFPQPQLPY LQLQPFPELPY (Fleckenstein et al., 2004; Wieser et al., 2004) 14

  15. Hypothesen zum Mechanismus Enzymdefekte (Peptidasemangel) Lektinartige Reaktionen Adenovirus-12-Infektion Primäre (Auto-) Immunreaktionen (Glutenpeptide/ Transglutaminase) (Schuppan, Dieterich, 1999) 15

  16. Analytik „Gluten“ Ausgangslage • A. CODEX STAN 118-1981:Bestimmung des N-Gehaltes (Kjeldahl)Grenzwert: 0,05 % N in der TM • Draft Revised Standard (2000)Extraktion mit 60 %igem Ethanol  ELISAGrenzwert: 20 mg Gluten/kg TM (von Natur aus „glutenfrei“)200 mg Gluten/kg TM („glutenfrei“ gemacht)Gluten = 2 x Prolamin • Codex Food Labelling Standard (2006 ?)Gluten = Allergen; Grenzwert  0 • Prolaminstandard, Antikörper, erhitzte Lebensmittel,Hydrolysate Probleme 16

  17. ELISA-Kit „Gluten“ (Skerritt u. Hill, 1991) Kalibrierkurven für Gliadine verschiedener Weizenarten (Wieser, Seilmeier, 1999) 17

  18. Herstellung eines Gliadinstandards Weizenkörner 30 kg Lipide vermahlen, entfetten Salzextraktion 60 % Ethanol AlbumineGlobuline Rohgliadin Ultrafiltration,Lyophilisation Gliadin Chemische CharakterisierungZertifizierung (IRMM) Standard  500 g (E. Berghofer, Wien; R. van Eckert, Graz; H. Wieser, Garching) 18

  19. Herstellung eines Antikörpers/ELISA Immunogen: Roggenprolamine (Secaline) Antikörper: monoklonal (R5) ELISA: Sandwich (R5 + R5-Meerrettichperoxidase) Spezifität: Gliadin, Secalin, Hordein (kein Avenin !) Epitop: - QQPFP - Nachweisgrenze: 3,2 µg Prolamin /kg Wiederholbarkeit: 7,7 % Reproduzierbarkeit: 8,1 % (Valdes et al., 2003) 19

  20. Analyse von erhitzten Produkten (1) Einfluss von 2-Mercaptoethanol auf die Kalibrierkurve des Gliadinstandards im R5-ELISA (Garcia et al., im Druck) 20

  21. Analyse von erhitzten Produkten (2) Wiederfindung von Gliadin in erhitzten Weizenteigen 60 % EtOH 2-ME + GUA °C °C M = Mehl = 100 % 21

  22. Analyse von erhitzten Produkten (3) Wiederfindung von Gliadin in Maisbrot a Gliadinstandard IRMM-480; Angaben entsprechen Gliadinprotein (= 86,4 % der Substanz). b Aus 10 g Mehl hergestellt und 10 min bei 240 °C verbacken. 22

  23. Zusammenfassung Analytik • Mit dem monoklonalen Antikörper R5 werden die Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit quantitativ erfasst. • Der kombinierte Einsatz von 2-Mercaptoethanol und Guanidin erlaubt die vollständige Extraktion der Prolamine auch aus erhitzten Produkten; die Effizienz des Antikörpers wird durch das Extraktionsmittel nicht beeinträchtigt. • In naher Zukunft wird ein zertifizierter Gliadinstandard zur Verfügung stehen. • Das entwickelte ELISA-System wurde in einem internationalen Ringtest erfolgreich getestet und vom „Codex Commitee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS)“ anerkannt. Seit kurzem sind kommerzielle Testkits erhältlich. • Haferprolamine und Weizenglutenine werden nicht erfasst. 23

  24. BMBF - Ideenwettbewerb BMBF - Leitprojekt Entwicklung von Weizen-, Roggen-, und Gerstenproteinen ohne Zöliakietoxizität und deren Verwendung zur Herstellung von Lebensmitteln (http://vvgvg.org) 24

  25. Ziele • Aufklärung toxischer Proteinstrukturen • Eliminierung toxischer Strukturen durch Gentechnologie • Produktion von zöliakieverträglichem, transgenem Weizen • Produktion von backfähigem, transgenem Mais • Produktion von zöliakieverträglichem Gluten durch transgene Hefe 25

  26. Partner Wissenschaft • Universität Hamburg Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten(H. Lörz, D. Becker) • Technische Universität Berlin Fachbereich für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie(U. Stahl, F. Meuser) • St. Thomas´ Hospital, London Rayne Institute(P.J. Ciclitira) • Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie, Garching Arbeitskreis Getreideproteine(H. Wieser) Industrie • Hauptsponsoren: Monsanto, Uniferm, Puratos, Bake Mark • Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten Getreideprodukten 26

  27. Teilprojekte Garching/London • Identifizierung und Modifizierung toxischer Epitope aus Gliadinen Immunmodulation ? • Toxizitätsprüfung von Gluteninen  Einsatz in glutenfreien Backwaren ? 27

  28. Toxizitätstests • In-vivo-Test (Instillation in den Dünndarm) 500 – 1000 mg • In-vitro-Test (Gewebekultur-Test) 1 mg • In-vitro-Test (Stimulation der T-Lymphozyten) 0,2 mg 28

  29. Zöliakieaktivität synthetischer Gliadinpeptide (in vivo, Sturgess et al., 1994; in vitro, Shidrawi et al., 1995) (in vivo, Marsh et al., 1995; in vitro, Maiuri et al.,1996) 29

  30. Stimulation der T-Lymphozyten durch Gliadinpeptide Zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten (in-vitro) durch Peptide aus -Gliadinen (57-68, 62-75) nach Desamidierung von Q65  E65 durch Transglutaminase (Arentz-Hansen et al., 2000) ! Kein Nachweis, dass diese Peptide in-vivo die Darmschleimhaut schädigen ! Keine systematische Untersuchung, welche Aminosäuren außer E65 für die stimulierende Wirkung essentiell sind 30

  31. Methoden (1) Gliadinhydrolysat Extraktion von Gliadin aus Weizenmehl der Sorte „Rektor“ mit 60 % (v/v) Ethanol  Partialhydrolyse von Gliadin mit trägergebundenem Pepsin und Trypsin( PT-Gliadin) Synthetische Peptide Gerät: Peptidsynthesizer (Applied Biosystems 431A) Programm: Fmoc-Chemie, Small-Scale-Synthese (1 mmol/Aminosäure) Reinigung: 1) C18-Kieselgel (25-40 µm), Glassäule 3 x 30 cm, ca. 20 °C 2) C18-Kieselgel (5 µm), Stahlsäule 0,46 x 24 cm, 50 °C Reinheitsprüfung: RP-HPLC an C18-Kieselgel Identitätsprüfung: Massenspektrometrie (ESI-MS) 31

  32. Methoden (2) Immunologische Untersuchungen T-Lymphozyten: Isolierung von gliadinsensitiven T-Zelllinien und -klonen von Zöliakiepatienten Stimulation:PT-Gliadin + Antigen-präsentierende Zellen (APC) Inkubation:T-Zellen + APC + Peptid (3,7 µmol/L) + 3H-Thymidin (18-48 h, 37 °C) Messung:Radioaktivität (cpm) cpm mit Peptid Stimulationsindex = SI > 2,0 = signifikante Wirkung cpm ohne Peptid Zytokine:ELISA Toxikologische Untersuchungen Personen:4 erwachsene Zöliakiepatienten unter glutenfreier Kost Instillation:1 g PT-Gliadin, 100 bzw. 20 mg Peptid, gelöst in Wasser, 2 h Biopsie:Gewebeentnahme mit Quinton-Kapsel nach 0, 2, 4 und 6 h Messung:Enterozytenhöhe (ECH), Villushöhe (VH), Kryptentiefe (CD), Anzahl intraepithelialer Lymphozyten (IEL) 32

  33. l l l l l l l l l l l l l l l l l l l Zellhöhe Gewebeentnahme IntraepithelialeLymphozyten Villus-höhe Krypten-tiefe (Messung an mind. 10 Villi) 33

  34. Peptide Toxikologische Untersuchung G8 (-Gliadin 56-75) C1 (ß-Casein 53-72) Immunologische Untersuchung G9 (-Gliadin 56-75, E65) G5 (-Gliadin 56-68, E65) G4 (-Gliadin 62-75, E65) 34

  35. Toxikologische Untersuchung (1) Enterozytenhöhe (ECH)(0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid  56-75 C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle) 35

  36. Toxikologische Untersuchung (2) Villushöhe/Kryptentiefe (VH/CD)(0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid  56-75 C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle) 36

  37. Toxikologische Untersuchung (3) Anzahl der Lymphozyten (IEL)(0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid  56-75 C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle) 37

  38. Immunologische Untersuchung (1) T-Zellklon Nr. 6 T-Zellklon Nr. 8 T-Zellklon Nr. 9 Sl = Stimulationsindex, IFN = -Interferon (pg/mL) 38

  39. Immunologische Untersuchung (2) Peptide SI/IFN (-) - - - - - - - - + + + + 39

  40. Immunologische Untersuchung (3) Peptide SI/IFN + + + + + + - - 40

  41. Zusammenfassung Toxikologie/Immunologie Die in-vivo-Toxizitätsprüfung an vier erwachsenen Zöliakiepatienten hat gezeigt, dass das Peptid G8 ( 56-75) eine signifikante zöliakiespezifische Schädigung der Dünndarmschleimhaut hervorruft. Die immunologischen Untersuchungen haben ergeben, dass das an Position 65 desamidierte Peptid G8 (G9) eine zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten bewirkt. Für die Wirkung des Peptids sind die Positionen 62-71 essentiell. 41

  42. Peptidbindungsstellen 42

  43. Toxizitätsprüfung der HMW-Glutenine Bauplan 90 785 1Dx5 A B C 827 105 585 A B C 1Dy10 627 Wiederkehrende Sequenzen 43

  44. Preparation of Crude HMW Subunits Flour (Rektor) 50 % 2-PrOH (3x, RT) Extract Residue 50 % 2-PrOH + DTE + Tris-HCl (2x, 60 °C) Extract Residue Solubles Precipitate washing, freeze-drying acetone 1Dx5 29.4 % 1Bx7 36.7 % 1By9 11.9 % 1Dy10 22.0 % HMW subunits 44

  45. RP-HPLC of Glutenin Fractions Total glutenin subunits Crude HMW subunits HMW 90 % HMW 20 % 45

  46. Characterisation of Purified HMW Subunits RP-HPLC SDS-PAGE 46

  47. ELISA-Result 47

  48. Peptic Tryptic Digest of HMW Subunits Control of hydrolysis by RP-HPLC on C18 silica gel • HMW subunits (400 mg) + agarose-bound pepsin (1600 U) + HCl (pH 2, 20 mL)37 °C, 2 h – centrifugation • Supernatant +NaOH ( pH 7.8) + agarose-bound trypsin (10 U) 37 °C, 2 h+ HCl ( pH 7.0) – centrifugation – lyophilisation of supernatant 48

  49. Stimulationstest an T-Lymphozyten Angegeben ist der Stimulationsindex (SI);SI>2 = signifikante Wirkung; Nd = nicht bestimmt. 49

  50. Ergebnisse ECH 50

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