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Régulation génétique par les petits ARN non-codants

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Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30). Régulation génétique par les petits ARN non-codants. Christophe ANTONIEWSKI antoniew@pasteur.fr. Découverte de l’interférence par l’ARN. Interférence par l’ARN. Injection. transfection. feeding. Viruses. ARN double-brin

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Presentation Transcript
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Institut Pasteur

« Génétique de la souris »

27 janvier (1h30)

Régulation génétique par les petits ARN non-codants

Christophe ANTONIEWSKI

antoniew@pasteur.fr

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Interférence par l’ARN

Injection

transfection

feeding

Viruses

ARN double-brin

Post Trancriptional Gene Silencing

(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)

Homology dependent Cosuppression

Inverted-repeat

transcription

Exogenous

Endogenous

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1ère partie: siRNA (small interfering RNA)

Luc dsRNA*

Cyc dsRNA*

S2 Extract

Dicer

Immunoprecipitation

Bernstein et al. Nature(2001) 409: 363

Elbashir et al. Genes & Development(2001) 15: 188-200

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Caractéristiques des siRNA

(O-Met-2’)

(2’-O-Met)

  • 19 nucléotides double-brin
  • 2 nucléotides débordants en 3’(OH)
  • Activité RNAi per se
  • Activité séquence-spécifique
  • Ciblent ARN sens et antisens
  • 2’-O-Met (in vivo)
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Williams RW, Rubin GM PNAS 2002

Le complexe RISC (RNA Induced Silencing Complex)

Argonautes

Deux groupes de protéines selon la présence d’aa conservés N-term:

AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires

Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale

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RNA Induced Silencing ComplexRISC

mRNA

degradation

Helicase ?

(Armitage/sde3)

DG

DG

R2D2 se fixe à l\'extrémité la + stable

Recrutant Dcr à l\'extrémité la - stable

R2D2 "reconnaît" le 5\'P du brin "passager"

Cleavage and release

of the "passenger" strand

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2ème partie: les microRNA

Lin-14, lin28

Lin-41, hbl1

lin-4

lin14

CDS

3’ UTR

ordres de grandeur
Ordres de grandeur

Genome

miRNA identifiés expérimentalement

~150

~150

~700

~700

C. elegans

D. melanogaster

M. musculus

H. sapiens

slide11

Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri-miRNA)

  • Pri-miRNA :
  • « Cappés »
  • Queue Poly-A
  • Pol II-dépendants

miRNA

autonomes

~50%

~50%

miRNA

"passagers"

Rare

pri mirna pr mirna
Pri-miRNA --> Pré-miRNA

Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006

pri mirna pr mirna le complexe microprocessor
Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »

Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006

biogen se des mirna
Biogenèse des miRNA

1

G

Biais 5’U

RISC

Mais quelle Argonaute ?

slide17

La séquence « graine » (seed)

Doench et al G&D 2004

Stark et al Plos Biol 2004

 Dur de trouver une cible de miRNA !

les mirna agissent aussi en d stabilisant les mrna cibles
Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles

Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770

miR124 fortement exprimé dans le cerveau

 Transfection de miR 124 dans des cellules Hela

 174 gènes réprimés (Niveau ARN)

slide19

Modèles d’action des miRNA

Eulalio et al, Cell 2008

slide20

Fonction des miRNAs au cours du développement

Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005

slide21

They target Bcl2, upregulated in many types of cancers

cMyc target + regulates E2F1

Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas

Amplified in B Cell lymphoma

miR17

miRNA et Cancers

Classification of human cancers using miRNA profiling

Lu et al (2005). Nature 435, 834

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3ème partie: les piRNA

Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112

  • 25 paires de bases
  • Biaisés en 5’: U (80% des cas)
  • 2’-O-méthylés à l\'extrémité 3’
  • Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons)  rasiRNA
  • surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules)

Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337–350.

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piRNAs

Co-immunoprécipitation par anti-Piwi

À partir d’extraits d’ovaires

Clonage/séquençage des petits RNA associés

Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-Piwi

Il correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA).

Saito et al., Genes and Dev (2006)

slide24

Les piRNA sont majoritairement « antisens »

Saito et al., Genes and Dev (2006)

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Dans la lignée germinale, les piRNA répriment l’expression des Elements Transposables

Vagin et al., Science (2006)

La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments

Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet

Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sont

Piwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)

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Séquençage direct de molécules uniques

Pyroséquençage « 4-5-4 »

From Margulies, M., et al. (2005).

Nature 437, 376-380.

Solexa, Solid, Helico…

10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt

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Biogenèse des endo-siRNA:

3 type de loci producteurs

Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons

Des ARN non-codants « structurés »

Les zones de recouvrement des 3’ UTR (gènes convergents)

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Transposon repression

Heterochromatin formation

Defense against viruses

Transposon repression

Heterochromatin formation

Regulation of

gene expression

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Mathieu Bartoletti

Bassam Berry

Corinne Besnard-Guerin

Anne-Laure Bougé

Caroline Jacquier

Josette Pidoux

Edwige Seguy

Hélène Thomassin

ad