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Régulation génétique par les petits ARN non-codants PowerPoint PPT Presentation


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Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30). Régulation génétique par les petits ARN non-codants. Christophe ANTONIEWSKI [email protected] Découverte de l’interférence par l’ARN. Interférence par l’ARN. Injection. transfection. feeding. Viruses. ARN double-brin

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Régulation génétique par les petits ARN non-codants

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Presentation Transcript


Institut Pasteur

« Génétique de la souris »

27 janvier (1h30)

Régulation génétique par les petits ARN non-codants

Christophe ANTONIEWSKI

[email protected]


Découverte de l’interférence par l’ARN


Interférence par l’ARN

Injection

transfection

feeding

Viruses

ARN double-brin

Post Trancriptional Gene Silencing

(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)

Homology dependent Cosuppression

Inverted-repeat

transcription

Exogenous

Endogenous


1ère partie: siRNA (small interfering RNA)

Luc dsRNA*

Cyc dsRNA*

S2 Extract

Dicer

Immunoprecipitation

Bernstein et al. Nature(2001) 409: 363

Elbashir et al. Genes & Development(2001) 15: 188-200


Caractéristiques des siRNA

(O-Met-2’)

(2’-O-Met)

  • 19 nucléotides double-brin

  • 2 nucléotides débordants en 3’(OH)

  • Activité RNAi per se

  • Activité séquence-spécifique

  • Ciblent ARN sens et antisens

  • 2’-O-Met (in vivo)


Williams RW, Rubin GM PNAS 2002

Le complexe RISC (RNA Induced Silencing Complex)

Argonautes

Deux groupes de protéines selon la présence d’aa conservés N-term:

AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires

Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale


RNA Induced Silencing ComplexRISC

mRNA

degradation

Helicase ?

(Armitage/sde3)

DG

DG

R2D2 se fixe à l'extrémité la + stable

Recrutant Dcr à l'extrémité la - stable

R2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager"

Cleavage and release

of the "passenger" strand


2ème partie: les microRNA

Lin-14, lin28

Lin-41, hbl1

lin-4

lin14

CDS

3’ UTR


Ordres de grandeur

Genome

miRNA identifiés expérimentalement

~150

~150

~700

~700

C. elegans

D. melanogaster

M. musculus

H. sapiens


Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri-miRNA)

  • Pri-miRNA :

  • « Cappés »

  • Queue Poly-A

  • Pol II-dépendants

miRNA

autonomes

~50%

~50%

miRNA

"passagers"

Rare


Pri-miRNA --> Pré-miRNA

Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006


Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »

Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006


Biogenèse des miRNA

1

G

Biais 5’U

RISC

Mais quelle Argonaute ?


« specialized » miRNA and siRNA pathways in Drosophila


Répression traductionnelle Vs clivage

Saxena et al JBC 2003


La séquence « graine » (seed)

Doench et al G&D 2004

Stark et al Plos Biol 2004

 Dur de trouver une cible de miRNA !


Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles

Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770

miR124 fortement exprimé dans le cerveau

 Transfection de miR 124 dans des cellules Hela

 174 gènes réprimés (Niveau ARN)


Modèles d’action des miRNA

Eulalio et al, Cell 2008


Fonction des miRNAs au cours du développement

Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005


They target Bcl2, upregulated in many types of cancers

cMyc target + regulates E2F1

Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas

Amplified in B Cell lymphoma

miR17

miRNA et Cancers

Classification of human cancers using miRNA profiling

Lu et al (2005). Nature 435, 834


3ème partie: les piRNA

Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112

  • 25 paires de bases

  • Biaisés en 5’: U (80% des cas)

  • 2’-O-méthylés à l'extrémité 3’

  • Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons)  rasiRNA

  • surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules)

Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337–350.


piRNAs

Co-immunoprécipitation par anti-Piwi

À partir d’extraits d’ovaires

Clonage/séquençage des petits RNA associés

Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-Piwi

Il correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA).

Saito et al., Genes and Dev (2006)


Les piRNA sont majoritairement « antisens »

Saito et al., Genes and Dev (2006)


Dans la lignée germinale, les piRNA répriment l’expression des Elements Transposables

Vagin et al., Science (2006)

La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments

Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet

Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sont

Piwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)


Séquençage direct de molécules uniques

Pyroséquençage « 4-5-4 »

From Margulies, M., et al. (2005).

Nature 437, 376-380.

Solexa, Solid, Helico…

10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt


Pyroséquençage… Et la lumière fut !


Origine génomique des loci producteurs de piRNA


Biogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophile


Deep sequencing of Ago2-associated small RNAs


Biogenèse des endo-siRNA:

3 type de loci producteurs

Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons

Des ARN non-codants « structurés »

Les zones de recouvrement des 3’ UTR (gènes convergents)


Endo-siRNAs silence transposable element in the soma

(as do piRNAs in the germ line)


Transposon repression

Heterochromatin formation

Defense against viruses

Transposon repression

Heterochromatin formation

Regulation of

gene expression


Mathieu Bartoletti

Bassam Berry

Corinne Besnard-Guerin

Anne-Laure Bougé

Caroline Jacquier

Josette Pidoux

Edwige Seguy

Hélène Thomassin


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