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Régulation génétique par les petits ARN non-codants PowerPoint PPT Presentation


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Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30). Régulation génétique par les petits ARN non-codants. Christophe ANTONIEWSKI [email protected] Découverte de l’interférence par l’ARN. Interférence par l’ARN. Injection. transfection. feeding. Viruses. ARN double-brin

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Régulation génétique par les petits ARN non-codants

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Presentation Transcript


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Institut Pasteur

« Génétique de la souris »

27 janvier (1h30)

Régulation génétique par les petits ARN non-codants

Christophe ANTONIEWSKI

[email protected]


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Découverte de l’interférence par l’ARN


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Interférence par l’ARN

Injection

transfection

feeding

Viruses

ARN double-brin

Post Trancriptional Gene Silencing

(dégradation de l’ARNm de séquence homologue)

Homology dependent Cosuppression

Inverted-repeat

transcription

Exogenous

Endogenous


R gulation g n tique par les petits arn non codants

1ère partie: siRNA (small interfering RNA)

Luc dsRNA*

Cyc dsRNA*

S2 Extract

Dicer

Immunoprecipitation

Bernstein et al. Nature(2001) 409: 363

Elbashir et al. Genes & Development(2001) 15: 188-200


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Caractéristiques des siRNA

(O-Met-2’)

(2’-O-Met)

  • 19 nucléotides double-brin

  • 2 nucléotides débordants en 3’(OH)

  • Activité RNAi per se

  • Activité séquence-spécifique

  • Ciblent ARN sens et antisens

  • 2’-O-Met (in vivo)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Williams RW, Rubin GM PNAS 2002

Le complexe RISC (RNA Induced Silencing Complex)

Argonautes

Deux groupes de protéines selon la présence d’aa conservés N-term:

AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires

Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale


R gulation g n tique par les petits arn non codants

RNA Induced Silencing ComplexRISC

mRNA

degradation

Helicase ?

(Armitage/sde3)

DG

DG

R2D2 se fixe à l'extrémité la + stable

Recrutant Dcr à l'extrémité la - stable

R2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager"

Cleavage and release

of the "passenger" strand


R gulation g n tique par les petits arn non codants

2ème partie: les microRNA

Lin-14, lin28

Lin-41, hbl1

lin-4

lin14

CDS

3’ UTR


Ordres de grandeur

Ordres de grandeur

Genome

miRNA identifiés expérimentalement

~150

~150

~700

~700

C. elegans

D. melanogaster

M. musculus

H. sapiens


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri-miRNA)

  • Pri-miRNA :

  • « Cappés »

  • Queue Poly-A

  • Pol II-dépendants

miRNA

autonomes

~50%

~50%

miRNA

"passagers"

Rare


Pri mirna pr mirna

Pri-miRNA --> Pré-miRNA

Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006


Pri mirna pr mirna le complexe microprocessor

Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor »

Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006


Biogen se des mirna

Biogenèse des miRNA

1

G

Biais 5’U

RISC

Mais quelle Argonaute ?


R gulation g n tique par les petits arn non codants

« specialized » miRNA and siRNA pathways in Drosophila


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Répression traductionnelle Vs clivage

Saxena et al JBC 2003


R gulation g n tique par les petits arn non codants

La séquence « graine » (seed)

Doench et al G&D 2004

Stark et al Plos Biol 2004

 Dur de trouver une cible de miRNA !


Les mirna agissent aussi en d stabilisant les mrna cibles

Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles

Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770

miR124 fortement exprimé dans le cerveau

 Transfection de miR 124 dans des cellules Hela

 174 gènes réprimés (Niveau ARN)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Modèles d’action des miRNA

Eulalio et al, Cell 2008


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Fonction des miRNAs au cours du développement

Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005


R gulation g n tique par les petits arn non codants

They target Bcl2, upregulated in many types of cancers

cMyc target + regulates E2F1

Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas

Amplified in B Cell lymphoma

miR17

miRNA et Cancers

Classification of human cancers using miRNA profiling

Lu et al (2005). Nature 435, 834


R gulation g n tique par les petits arn non codants

3ème partie: les piRNA

Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112

  • 25 paires de bases

  • Biaisés en 5’: U (80% des cas)

  • 2’-O-méthylés à l'extrémité 3’

  • Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons)  rasiRNA

  • surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules)

Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337–350.


R gulation g n tique par les petits arn non codants

piRNAs

Co-immunoprécipitation par anti-Piwi

À partir d’extraits d’ovaires

Clonage/séquençage des petits RNA associés

Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-Piwi

Il correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA).

Saito et al., Genes and Dev (2006)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Les piRNA sont majoritairement « antisens »

Saito et al., Genes and Dev (2006)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Dans la lignée germinale, les piRNA répriment l’expression des Elements Transposables

Vagin et al., Science (2006)

La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments

Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet

Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sont

Piwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Séquençage direct de molécules uniques

Pyroséquençage « 4-5-4 »

From Margulies, M., et al. (2005).

Nature 437, 376-380.

Solexa, Solid, Helico…

10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Pyroséquençage… Et la lumière fut !


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Origine génomique des loci producteurs de piRNA


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Biogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophile


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Deep sequencing of Ago2-associated small RNAs


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Biogenèse des endo-siRNA:

3 type de loci producteurs

Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons

Des ARN non-codants « structurés »

Les zones de recouvrement des 3’ UTR (gènes convergents)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Endo-siRNAs silence transposable element in the soma

(as do piRNAs in the germ line)


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Transposon repression

Heterochromatin formation

Defense against viruses

Transposon repression

Heterochromatin formation

Regulation of

gene expression


R gulation g n tique par les petits arn non codants

Mathieu Bartoletti

Bassam Berry

Corinne Besnard-Guerin

Anne-Laure Bougé

Caroline Jacquier

Josette Pidoux

Edwige Seguy

Hélène Thomassin


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