Contaje de placa aeróbica, Tinción Gram y Aislamiento

1. Contaje de placa aeróbica, Tinción Gram y Aislamiento Laboratorio de Microbiología de Alimentos

2. Contaje de placa aeróbica • Provee un estimado general de bacterias aeróbicas vivas • Evalúa calidad • Predictor de “shelf-life” • Monitoreo ambiental • Excluye • Anaerobos obligados • Microaerofílicos

3. Contaje en placas • Asume • Cada colonia proviene de una sola célula bacterial • Algunas colonias puede ser originadas de una “agrupamiento”de bacterias • Se reporta como - Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ó ml. - NO como bacterias totales

4. Resultados del Contaje de placa aeróbica • Evalúa la sanitación de una producto • Predice la durabilidad (Shelf-life) • Indicador de seguridad (Safety) • Monitorea el ambiente

5. Limitaciones del contaje de placa aeróbica • Sólo se consideran organismos aeróbicos • No se sabe el tipo de bacteria • El medio de cultivo permite el crecimiento de ciertas bacterias • Limitaciones visuales/Errores humanos • Difícil de distinguir entre partículas de alimentos y bacterias • No se debe utilizar en alimentos fermentados • Las colonias podrían ser muy pequenas para verse

6. Tipos de muestra • Líquidas • Líquidos no viscosos se miden con pipetas • Líquidos viscosos se pesan • Sólidas • Pesar asépticamente • Hisopo • Tomar muestra pasando un hisopo por un área definida • Ambientales y de envases • Enjuage el interior del envase • Abra una placa para tomar una muestra del aire • Placas RODAC

7. Protocolo para Contaje en Placas • Prepare un homogenado de la muestra • Dilución 1:10 • 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen total • Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2 minutos 10 g/ml muestra 90 ml of diluyente 1:10 Dilución – 10-1

8. Protocolo para contaje en placas • Prepare diluciones seriadas • Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 20-200 en una placa • Utilice una pipeta estéril entre cada dilución • Ponga la pipeta usada en el área designada • Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos • Use amortiguador de fosfato o peptona para diluir

9. Diluciones Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent Sample Homogenate 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 (1:100) (1:1000) (1:100000) (1:10) (1:10000)

10. Placas Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish 10-4 10-5 10-2 10-3 10-1 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

11. Protocolo Contaje de placas • Anada 18-20 ml de agar (45-50F), a la placa petri • El agar no puede estar muy caliente porque mata las bacterias • Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar) • Mueve 10x en cada dirección • Deje que solidifique • Incube las placas invertidas a 35-37 por 48 horas.

12. Esterilización • El equipo y el medio de cultivo debe estar estéril • Esterilización en aire caliente • 170 C por una hora • Ponga en horno por 2 horas luego que éste alcance la temperatura • Envuelva en papel o papel de aluminio • Esterilización por vapor • 121C por 15 min. Debe alcanzar el autoclave 15 psi de presión • Equipo y medio líquido • No ponga las tapas apretadas

13. Tinción Gram • Gram positivo ó negativo • Basado en la estructura de la pared • Gram positivo • Pared gruesa por la capa de peptidoglicano • Gram negativo • Capa fina con presencia del lipopolisacárido

14. Obtención de colonias aisladas • La meta es obtener colonias aisladas del alimentos y/o cultivo • Las colonias pueden ser identificadas y evaluadas • Collect loopful of culture • Streak in each area starting • with area 1 • Flame Loop in between • areas 2 1 3 4

15. Contaje de placas • Sólo cuente las placas que tengan entre 20 y 200 colonias • Más de 200 • TNTC • Menos de 20 • TFTC

16. Plate 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1 TNTC1 TNTC TNTC 200 192 2 TNTC TNTC TNTC 150 10 Average - - - 175 - Contaje de placas 1 Too Numerous to Count 2 Too Few to Count • Average two countable plates and Multiply by Dilution Factor • Count is 175 x 104 • Must Convert to TWO Significant Digits • 1.8 x 106 cfu/ml or g

17. Plate 10-1 10-2 10-3 10-4 1 TNTC 300 150 10 2 TNTC 200 100 20 Average - 250 125 TFTC Contaje-Ejemplos Use ALL FOUR even though 300 is outside range. If ONE PLATE is in RANGE, use BOTH for Average. 250 x 102 – 2.5 x 104 125 x 103 – 1.3 x 105 AVERAGE – 7.8 x 104 cfu/g or ml

18. Plate 10-1 10-2 10-3 10-4 1 TNTC TNTC TNTC 300 2 TNTC TNTC TNTC 400 Average - - - 350 Contaje - Ejemplos All Dilutions are outside Range so we MUST use counts Outside range 350 x 104 – 3.5 x 106 cfu/ml or g* Use an “*” when using dilutions outside countable ranges This means it is an ESTIMATED count

19. Plate 10-1 10-2 10-3 1 TNTC 300 10 2 TNTC 400 5 Average - 250 125 Contaje- Ejemplos If Both Dilutions are outside Range, use the Higher Dilution (LOWER COUNTS) 7.5 x 103 cfu/ml or g*

20. Placas con muchas colonias • Cuente la dilución mayor y utilice las rejillas en el contador de colonias • 1 rejilla = 1 cm2 • Una placa plástica estándar tiene 56 cm2 de área de superficie • Si <10 colonias/cm2 cuente 12 cuadrados (6 consecutivos verticales y 6 consecutivo horizontales) • Totalice y divida por 12 (promedio). Multiplique por 56 para obtener • el número total de colonias en la placa. Reporte como estimado • Si >10 colonias/ cm2 • Cuente 4 cuadrados, promedie y multiplique por 56

21. Variaciones al contaje aérobico • Psicotróficos • Incube a 5-7 C por 10 días • Use esparcido • Termodúricos • Ponga 5 ml de la muestra o la dilución 1:10 de la muestra sólida en bano de agua entre 60-80n C por 30 minutos • Enfríe en hielo por 10 minutos • Ponga en placa e incube

22. Primer Período

23. Esquema

24. Segundo Período

25. Petrifilms

26. Ventajas Rápido Menos espacio Fáciles No hay que preparar medio Distinción entre CFU vs. Partículas de alimentos Desventajas Morfología de la colonia Costoso Difícil de leer Ventajas y desventajas de utilizar los petrifilms