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质粒 DNA 制备. 一、质粒简介. 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状 DNA 分子 其大小范围从 lkb 至 200kb 以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 . 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。. 质粒通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子． 1946 年， Lederburg 和 Fatum 发现的 F 因子是最早发现的质粒， F 因子与高等生物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。 1952 年，由 Lederburg 正式命名为质粒。.
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一、质粒简介 • 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 • 其大小范围从lkb至200kb以上不等。 • 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. • 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子．质粒通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子． • 1946年， Lederburg和Fatum发现的F因子是最早发现的质粒，F因子与高等生物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。 • 1952年，由Lederburg正式命名为质粒。
确切地说，质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞表型，是比病毒更简单的原始生命。确切地说，质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下对细菌宿主有利。质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下对细菌宿主有利。 • 由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等等。
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术．质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术．
1. 分子相对小 • 在5kb左右，质粒较小，比较稳定，不易受物理因素的损伤，此外，较小的质粒一般有较高的拷贝数。
2. 含有高效的自主复制成分 • 质粒的复制与宿主细胞的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA停止复制，但这种质粒可继续利用细菌原有的酶系进行复制
质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作用调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌染色体DNA复制所用的同一套酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复制及转录。质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作用调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌染色体DNA复制所用的同一套酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复制及转录。
根据所含复制起始区的不同，有些质粒的复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处于“严密控制”。根据所含复制起始区的不同，有些质粒的复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处于“严密控制”。
有些质粒则处于“松弛控制”，每个细胞可含达15-20乃至数百拷贝的质粒。这类质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯霉素)、染色体DNA停止复制的条件下，拷贝数继续增加至数千。有些质粒则处于“松弛控制”，每个细胞可含达15-20乃至数百拷贝的质粒。这类质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯霉素)、染色体DNA停止复制的条件下，拷贝数继续增加至数千。
3.不相容性 • 利用同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处，可称之为不相容质粒，当两个上述质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。
由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不总能保持相同。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重地失衡。由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不总能保持相同。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重地失衡。
在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但不会兼而有之。在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但不会兼而有之。
通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能力，可以把它们分为若干不相容组。带有相同复制子的质粒属于同一不相容组，而带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。现已发现30多个这样的不相容组。通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能力，可以把它们分为若干不相容组。带有相同复制子的质粒属于同一不相容组，而带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。现已发现30多个这样的不相容组。
4. 转移性 • 在自然条件下，很多质粒都可以通过一种称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
5. 选择的标记 • 质粒应带有一个或几个可供选择的标记，便于对转化株的筛选。
常用来作为标记的有氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因，此基因编码β—内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素的β—内酰胺环使之失效，从而赋予细菌抗药性。
另一常用的抗药性基因为四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因，该基因编码一种含399氨基酸残基的膜相关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。 • ampr基因或tetr基因若被外源基因插入，便失去相应的抗药性，便于分子克隆的筛选。
大肠杆菌的lac Z基因也常被用作为选择的标记，此基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基因(x)与半乳糖以糖苷键连结成的化合物x-gal。 • 半乳糖苷酶 • X-gal X + gal • 无色 蓝色产物 半乳糖
若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X—gal，此菌落成为蓝色。 • 若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。
6. 限制性内切酶单一切口 • 在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。 • 若这种单一的限制性内切酶位点处于选择标记基因的内部，外源基因片断插入后会导致该基因失活便于筛选。
1. pBR322 • pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为4 363bp，由3种野生型质粒成分组成，ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01，复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号，以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核苷酸。
2. pUC系统 • 如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位点接头的方向正好相反。
3．表达载体 • 载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等。
1．细菌的培养： • 先分离单个菌落， 接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。
对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增。对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增。
对于新一代的质粒如pUC系列等，由于宿主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利用氯霉素对质粒DNA的选择性扩增并不十分必要。对于新一代的质粒如pUC系列等，由于宿主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利用氯霉素对质粒DNA的选择性扩增并不十分必要。
长时间在氯霉素存在下，质粒DNA合成过程中，复制链中会掺入核糖核苷酸，对碱性条件敏感，将会导致大量的缺口环状DNA和线性质粒的产生．长时间在氯霉素存在下，质粒DNA合成过程中，复制链中会掺入核糖核苷酸，对碱性条件敏感，将会导致大量的缺口环状DNA和线性质粒的产生．
但有些人仍然偏爱用氯霉素选择性扩增质粒，其理由是在中等体积培养物中能获取与大量培养物等同的质粒产量。而且细菌量的减少，使得裂解物的复杂性和粘稠度降低，操作更方便、有效，对煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量．但有些人仍然偏爱用氯霉素选择性扩增质粒，其理由是在中等体积培养物中能获取与大量培养物等同的质粒产量。而且细菌量的减少，使得裂解物的复杂性和粘稠度降低，操作更方便、有效，对煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量．
有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。 • 这种低效率扩增，可利用高营养培养基促进生长，一般可增加质粒产量4-6倍。
2．细菌的收集与裂解 • 细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。
细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。 • 不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。
3．质粒DNA纯化 • 质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。
但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNA。但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNA。
转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。
对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。
（二） 质粒DNA的制备 • 质粒DNA的小量制备2-5ml • 质粒DNA的大量制备500ml • 碱裂解法 • 煮沸法 • SDS裂解法 • Triton-溶菌酶法
