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Western blot 实验技术

Western blot 实验技术. Western 免疫印迹（ Western Blot ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 Western 实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术，在实验过程中会遇到很多的问题，每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。. 实验流程. √. 蛋白提取 SDS 凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色. 蛋白提取. 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂. 变性裂解液. 非变性裂解液.

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Western blot 实验技术

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  1. Western blot 实验技术

  2. Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 • Western实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术，在实验过程中会遇到很多的问题，每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。

  3. 实验流程 √ 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色

  4. 蛋白提取 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 变性裂解液 非变性裂解液

  5. 细胞和组织的处理 • 问题一. RIPA裂解液裂解细胞，离心后，还有很多粘稠物质 ？ RIPA裂解细胞后的粘稠物质主要是DNA，10000rpm以上离心五分钟就可以沉淀， 取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。

  6. 细胞和组织的处理 • 问题二.组织应该如何裂解最合适？ 1、对于有韧性的组织比如血管，神经等，不能选用玻璃匀浆器，可以选择手动匀浆器和液氮研磨 2、对于一般较柔软的组织比如脑，肝脏等，使用上述三种方法均可。

  7. 细胞和组织的处理 • 问题三.液氮研磨后离心样本不能分层 • 研磨的时候不充分，会形成絮状的液态物质，如有手动匀浆器可以再进行处理 注意： • 裂解时抑制剂的添加非常重要，做一般的蛋白加入PMSF即可，个别蛋白需要加Aprotinin， Leupeptin ，做磷酸化的蛋白需要加入磷酸酶抑制剂（cocktail）

  8. 细胞和组织的处理 • 问题四.提取的蛋白样本如何保存最合适？ 解答：温度越低越好 1、液氮 2、-80度冰箱 3、-30度冰箱 4、加入loading buffer煮后保存于-20度。

  9. 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 √

  10. SDS－PAGE电泳 • （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗 • 过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 • （2）灌胶与上样 • 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 • 2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面 • 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才 • 不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。） • 3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固 • 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 • 4、按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间 • 灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免 • 胶中有气泡产生。TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

  11. 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）

  12. SDS凝胶配制 • 问题一.胶凝的效果不好是什么原因？ 1、AP时间过长，重新配制AP 2、可以适当多加入TEMED 3、室温低 4、混合不均匀

  13. SDS凝胶配制 问题二、丙烯酰胺母液可以储存多久？ 1、丙烯酰胺隔月重新配制 2、配制完分离胶要覆盖一层0.01%的SDS溶液，防止表面与空气接触。如果加一层水也可以，但由于水具有表面张力，会使胶不平。

  14. 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 √

  15. 电泳 • 电泳时间一般2～3 h，电压为根据分子量需要，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

  16. 电 泳 • 问题一.如果所做蛋白分子量很大，比如220KD，大分子的Marker跑不下去，怎么办？小分子量的蛋白如10KD左右应该注意什么？ 大分子：使劲跑；小分子：谨慎跑

  17. 电 泳 • 问题二.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。 也可能母液（30%聚丙烯酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察

  18. 电 泳 • 问题三.怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，灌胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，再高电压? 影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。 2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。

  19. 电 泳 • 问题四：电泳时上样量应为多少？ 这个没有确切的定值，一般来说20微克就可以，但是如果你的样品中目的蛋白含量很少，可以加大上样量到60微克甚至更高（进行预实验）

  20. 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 √

  21. 电 转 • 问题一.电转选择什么样的膜最好？ PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用。

  22. 电 转 • 膜的选择还要考虑到目的蛋白分子量的大小，如果目的蛋白分子量为20KD以下，最好用0.22微米的膜，大于20KD可以选择0.45微米的膜。

  23. 电 转 • 问题二.电转时膜、滤纸、胶大小有何讲究？ 如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。 绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

  24. 电 转 • 问题三.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇，因为甲醇可增加蛋白质和膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间 转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的膜（0.2微米）

  25. 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 √

  26. 封闭及一抗 • 问题一.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下? 均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。

  27. 封闭及一抗 • 问题二.一抗的浓度为多少合适？ 不同的抗体效价是不一样的，一些好的公司的抗体可以稀释到1：1000或更多，一般的抗体稀释比例为1：200——1：500,如果低于这样的稀释比例，说明抗体质量太差。

  28. 封闭及一抗 • 问题三.洗脱的时候用PBST还是TBST，也有人用PBS和TBS，到底用那个合适？ 都可以，最好用加tween-20的缓冲液，也就是PBST和TBST。

  29. 封闭及一抗 • 问题四.封闭液的选择有什么区别吗？ 一般用BSA或者脱脂奶粉 脱脂奶粉封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会形成干扰）

  30. 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 √

  31. 显 色 • 问题一.发光液用DAB显色好还是用ECL好？ 一般的说，ECL比DAB更灵敏，从实验的结果来看，个人认为ECL更好一些。（选择进口发光液）

  32. 显 色 • 问题二.加上ECL发光液能看到很亮的条带，而放入显影液和定影液洗完后，却发现条带很模糊，这是为什么？ 显影液使用次数太多，已经失效。更换新的显影液。显影液在使用数次后会发黄，这时要及时更换。而定影液只要是清亮的就可以一直用。（注意避光保存）

  33. 显 色 • 问题三.背景很脏是什么原因？ 1.没有洗干净（使用PBST或者TBST） 2.一抗浓度过大，可以降低一抗浓度 3.二抗浓度过大 4. 封闭时间短 5. 抗体稀释液效果不好

  34. 显 色 • 问题四.同一张膜如何进行蛋白的反复检测？ 使用膜修复液洗15-30分钟，再用PBST或TBST洗3×10min。然后再封闭，加一抗。一般每张膜可以反复检测4-5次。

  35. 显 色 • NC膜是通过疏水作用来和蛋白质相连，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。 • PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，虽然也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

  36. 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色

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