TRABAJO FIN DE CARRERA

1. TRABAJO FIN DE CARRERA “CONTROL BIOLÓGICO DE Fusarium oxysporum f. sp. melonis RAZA 1.2 CON ANTAGONISTAS”. ALUMNA: RAQUEL SOBRINO RUBIO. DIRECTORES DEL PROYECTO: - Mª LUISA SORIANO MARTÍN - ANDRÉS PORRAS PIEDRA FECHA DE PRESENTACIÓN: MAYO 2005.

2. IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL CULTIVO DEL MELÓN • PRODUCCIÓN EN ESPAÑA DE 1 MILLÓN DE TONELADAS • SUPERFICIE: -75% CULTIVOS AL AIRE LIBRE -25% CULTIVOS PROTEGIDOS • EN CLM90% EN CIUDAD REAL

3. INTRODUCCIÓN A LA FUSARIOSIS VASCULAR DEL MELÓN • condiciones de desarrollo ~20º C. • primeros trabajos sobre el estado sanitario de los melonares de Levante y Murcia en 1976. • en 1985 se describe la micosis en cultivos bajo plástico en Almería.

4. DIFICULTAD DE CONTROL DE LA FUSARIOSIS VASCULAR • enfermedad muy virulenta. • reducción de la producción hasta un 90% .

5. VENTAJAS respetuoso con el medio ambiente no existen problemas de intoxicaciones no crea resistencia eliminación casi completa de la utilización de productos fitosanitarios INCONVENIENTES ignorancia sobre su utilización falta de apoyo económico falta de personal especializado enemigos naturales susceptibles a productos fitosanitarios INTRODUCCIÓNAL CONTROL BIOLÓGICO

6. INTRODUCCIÓN A LOS MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS 1. ocurre con frecuencia en la naturaleza. 2. interacción continua entre patógenos potenciales y sus antagonistas. -equilibrio dinámico en la superficie del suelo- 3. microorganismos antagonistas: - BACTERIAS: Bacillus y Pseudomonas - HONGOS: Trichoderma yMicorrizas Arbusculares

7. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ANTAGONISTAS • Competencia:debe existir “escasez” de un elemento. La competencia más común es por nutrientes, oxígeno o espacio. • Interacción directa con el patógeno: -Parasitismo: un microorganismo parasita a otro. - Predación: el antagonista se alimenta de materia orgánica entre la cual ocasionalmente se encuentra el patógeno. • Antibiosis y lisis:inhibición del crecimiento de un organismo por la acción de una sustancia producida por otro organismo.

8. OBJETIVOS 1. ESTUDIAR EL POSIBLE ANTAGONISMO FRENTE A FomMEDIANTE ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITRO 2. DETERMINAR LA EFICACIA DE LOS ORGANISMOS SELECCIONADOS EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE FomRAZA 1.2 EN PLÁNTULAS DE MELÓN 3. DETERMINAR LA EFICACIA DE LA COLONIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN CON MICORRIZAS VESÍCULO-ARBUSCULARES EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE Fom.

9. MATERIALES Y MÉTODOS

10. ANTAGONISTAS UTILIZADOS EN EL CONTROL BIOLÓGICO • Trichoderma harzianum • Aspergillus A5, Aspergillus A8, Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus • Penicillum sp • Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens • Bacillus subtilis • Fusarium oxysporum no patogénicos • Glomus mosseae, Glomus intraradices, Glomus claroideum

11. MATERIAL VEGETAL Y PATÓGENO • SEMILLAS DE MELÓN DEL CULTIVAR AMARILLO CANARIO F1 HÍBRIDO. • Fusarium oxysporum f. sp. melonis RAZA 1.2 AISLADO CR 6801

12. REPICADO DE Fom EN PDA. - repicado del patógeno en placas de petri con PDA. - estufa: 252º C, 7 días. REPICADO DE Fom EN CPD. -explante en matraz erlenmeyer. -agitador orbital (120 rpm), 25-27ºC, 16 horas luz, 6 días. -filtrado del hongo. -cuantificación de la densidad del inóculo. -ajuste de la concentración de inóculo. PRODUCCIÓN DE INÓCULO DEL PATÓGENO

13. CULTIVO DUALIN VITRO • CULTIVO DUAL consiste en el enfrentamiento del patógeno y el antagonista en una placa de petri, analizando el crecimiento de ambos que se compara con el crecimiento individual de cada uno de ellos. • SEPARACIÓN: - 7 cm (HONGOS) - 5 cm (BACTERIAS) • ENSAYO: 3 PLACAS DE PETRI, 4 REPETICIONES TESTIGOS DE PATÓGENO TESTIGOS DE ANTAGONISTA

14. CULTIVO DUAL DE Fom Raza 1.2 CON Trichoderma harzianum • pequeña cantidad del preparado de T. harzianum con pinzas esterilizadas en una placa de petri con PDA. • enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de Fom y T. harzianum. • placa de petri en estufa (27ºC). • mediciones del diámetro de las colonias cada 48 horas.

15. CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON Aspergillus A5, Aspergillus A8 y Penicillum sp. • repicado de los hongos de la placa original en PDA. • enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de Fom con Aspergillus y Penicillum. • placa de petri en estufa (27ºC). • mediciones del diámetro de las colonias cada 48 horas.

16. CULTIVO DUAL DE FomRAZA 1.2 CON Aspergillus terreus, A. flavus y A. ochraceus. • recuperación de los hongos liofilizados. • enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de Fom y Aspergillus. • placa de petri en estufa (27ºC). • mediciones del diámetro de las colonias cada 48 horas.

17. CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida. 1. recuperación de las bacterias liofilizadas. 2. ensayo en: PDA y AGAR NUTRITIVO 3. enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de Fom y Pseudomonas en Agar Nutritivo (separación de 5 cm). 4. placa de petri en estufa (27ºC) 5. mediciones del diámetro de las colonias cada 48 horas

18. ENSAYO EN PDA - ENFRENTAMIENTO DE EXPLANTES DE 5 mm DE DIÁMETRO DE Fom Y Bacillus subtilis EN PDA (SEPARACIÓN DE 5 CM). - PLACA DE PETRI EN ESTUFA (27ºC) - MEDICIONES DEL DIÁMETRO DE LAS COLONIAS CADA 48 HORAS. ENSAYO CONTENIENDO EXUDADO DE Bacillus subtilis. ENSAYO CON EXUDADOS DE Bacillus subtilis. - 5 EXPLANTES DE 5 mm. - MATRAZ ERLENMEYER CON CPD. - AGITADOR ORBITAL (120 rpm, 7 DÍAS, TOTAL OSCURIDAD, TEMPERATURA AMBIENTE). COMPROBACIÓN DEL CRECIMIENTO. SE AÑADE AGAR. EXPLANTE DE Fom. COMPROBACIÓN DEL DIÁMETRO DE LA COLONIA DE FOM CADA 48 HORAS. CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON Bacillus subtilis.

19. CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON Fo NO PATOGÉNICO • repicado de los hongos de la placa original en PDA • enfrentamiento de explantes de 5 mm de diámetro de Fom con FoNO PATOGÉNICO. • placa de petri en estufa (27ºC) • mediciones del diámetro de las colonias cada 48 horas

20. CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO

21. PRODUCCIÓN DE Trichoderma harzianum DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE INÓCULO DEL PREPARADO COMERCIAL “MÉTODO DE LAS DILUCIONES” • PDA CON NYSTANINA AL 1%. • DILUCIÓN DEL PREPARADO COMERCIAL EN 9 ml DE AGUA. • DILUCIONES EN 6 VIALES. • PLACAS DE PETRI EN ESTUFA (27ºC) • OBSERVACIÓN DE PLACAS CADA 12 HORAS.

22. PRODUCCIÓN DE Aspergillus A5 • repicado del hongo en PDA en placa de petri con PDA (7 días,25-27ºC, oscuridad) • repicado del hongo en CPD - 5 explantes de 5mm de diámetro en matraz de CPD - agitador orbital 120 rpm en cámara de crecimiento (6 días, 25-27ºC, 16 horas de luz) • filtrado del hongo • cuantificación de la densidad de inóculo • ajuste de la concentración de inóculo

23. GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE MELÓN • germinación en placas de petri - capa de vermiculita - disco papel secante esterilizado - semillas - disco de papel secante esterilizado • cámara de crecimiento (3 días, 25-27ºC, 16 horas luz) • plantación en vasos de plástico perforados en la base o bandejas de alvéolos • Etiquetan y enumeran con el antagonista utilizado. • cámara de crecimiento (12 días)

24. APLICACIÓN DE LOS ANTAGONISTAS AL SUBSTRATO • CADA ENSAYO: - 40 plántulas (4 repeticiones de 10 plántulas cada una) - 10 plántulas testigos antagonistas (control +) - 10 plántulas testigo con inóculo del patógeno (control -) - 10 plántulas testigo sin tratar (control ) • SUBTRATO ESTÉRIL Y SUBTRATO NO ESTÉRIL

25. SUBSTRATO • El substrato estéril se utiliza para observar el comportamiento de los microorganismos antagonistas y Fom sin que se encuentre sometido a la acción de otros microorganismos que se puedan hallar en el substrato (bacterias, hongos, etc.). • Los ensayos en substrato no estéril se realizan para observar el comportamiento de los microorganismos antagonistas y Fom en las condiciones en las que se encontrarían las plántulas de melón en el invernadero.

26. TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON Trichoderma harzianum • Ensayos: a) dosis 55 gr/kg de substrato b) dosis 27.5 gr/kg de substrato • Mezclar de forma homogénea • Vasos de plástico perforados • Bandejas de alvéolos • Semilla germinada de melón • Cámara de crecimiento

27. TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON Aspergillus A5 • Suspensión conídica concentración 107 conidias/ml • En 100 ml de substrato se añaden 10 ml de suspensión conídica • Mezcla homogénea • Semilla germinada de melón • Cámara de crecimiento

28. TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON MICORRIZAS • En 150 ml de substrato se añade una cucharilla de café rasa del preparado micorrízico • Semilla de melón germinada • Cámara de crecimiento

29. INOCULACIÓN DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN CON EL PATÓGENO • Suspensión de 5 x 105 conidias/ml de Fom Raza 1.2 • Se añaden 10 ml de suspensión a cada vaso que contiene las plántulas de melón. • Cámara de crecimiento

30. REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDA. REAISLAMIENTO  siembra en PDA de fragmentos de raíz, cuello y tallo (desinfestados) para comprobar si el patógeno ha sido capaz de colonizar el sistema vascular de las plantas tratadas con antagonistas e inoculadas con Fom

31. CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON MICORRIZAS ARBUSCULARES. • A los 30 días del tratamiento. • 3 plantas por ensayo • Lavado de raíces • Fragmentos de 2-3 cm • Decoloración de raíces con KOH al 10%, temperatura ambiente • Lavado y acidificación con CLH 0.1N durante 30 minutos. • Tinción con Azul Tripán (4 horas) • Intervalos de 15 min, lavado con agua • Colocación de fragmentos en un porta-objetos de forma paralela Con el microscopio se realizan observaciones verticales en el porta-objetos tomando como referencia una distancia constante de 0.2 mm, y se anotan en 100 intersecciones si están o no micorrizadas.

32. EVALUACIÓN DE LA INCIDENCIA Y SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD ESCALA DE SEVERIDAD 0 0% PLANTA SANA 1 0-10% SÍNTOMAS LEVES 2 10-50% SÍNTOMAS SEVEROS 3 50-75% SÍNTOMAS MUY SEVEROS 4 >75% PLANTA MUERTA

33. RESULTADOS

34. 1. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITRO • Finalización del ensayo: • Unión física entre las colonias de antagonista y patógeno • Halo de separación constante durante varias mediciones

35. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITRO Halo de inhibición entre el patógeno y Aspergillus A5

36. DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DE INÓCULO DEL PREPARADO COMERCIAL DE Trichoderma harzianum • conteo a las 48 horas de realizarse las diluciones - incontables - placas dilución -6 contables • resultado total 16.6 x 107 u.f.c en el paquete original de Trichoderma harzianum

37. RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 55 g/kg substrato estéril. Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 55 g/Kg substrato no estéril.

38. RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 55 g/kg substrato estéril (transplante). Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/kg substrato estéril.

39. RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg substrato estéril, transplante. Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg substrato no estéril.

40. RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Glomus mosseae. Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Aspergillus A-5.

41. RESULTADO DEL CONTROL BIOLÓGICO IN VIVO Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Glomus claroideum. Curva de progreso de la enfermedad tras infectar las plantas con el patógeno (testigo control -) y comparación con los valores medios del ensayo utilizando como antagonista Glomus intraradices

42. RESULTADO DEL REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDA Reaislamiento del patógeno de planta tratada con Trichoderma harzianum utilizando la dosis recomendada (substrato no estéril) • En todas las pruebas de aislamiento se dio positivo en cuanto a infestación de las plantas por Fusarium oxysporum f. sp. Melonis. Reaislamiento del patógeno en PDA de plantas tratadas con Glomus intraradices

43. REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDA Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de plantas tratadas con distintas dosis de Trichoderma harzianum, en substrato estéril (SE) y no estéril (SNE), procedentes de explantes de raíz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).

44. REAISLAMIENTO DEL PATÓGENO EN PDA Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de plantas tratadas con Micorrizas Arbusculares, en sustrato estéril (SE), procedentes de explantes de raíz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).

45. 3.RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A. • Los porcentajes de raíz micorrizada obtenidos son los siguientes: - Glomus intraradices: 10’12 % - Glomus mosseae: 10’41 % - Glomus claroideum: 10’23 % Resultado del cálculo del porcentaje de micorrización de las raíces de las plántulas de melón tratadas con micorrizas.

46. RESULTADO DEL CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN DE LAS RAÍCES DE LAS PLÁNTULAS DE MELÓN TRATADAS CON M.A. Observación de la micorriza por el microscopio, donde se aprecian vesículas dentro de la raíz.

47. 4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS Comparativa de las diferentes curvas de progreso de la enfermedad de los ensayos realizados

48. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS • En los diferentes ensayos realizados, se ha podido observar que las plántulas de melón tratadas con Trichoderma harzianum (55 gr/kg substrato estéril) y Glomus claroideum, han conseguido retardar el proceso de infección del patógeno Fom raza 1.2 en 8 días, siendo la media de los demás ensayos de 5,8 días. • Se ha comprobado de igual forma que tras el reaislamiento del patógeno en PDA en todos los ensayos realizados, éste se ha desplazado de forma sistémica por toda la plántula produciendo la muerte.

49. 5. RESULTADO DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO • ANOVA Table: En los ensayos realizados no hubo diferencias significativas entre las variables, con un 95% de nivel de confianza. • MULTIPLE RANGE TESTS: En los ensayos realizados no hubo diferencias significativas entre los pares de datos, con un 95% de nivel de confianza.

50. CONCLUSIONES • Los microorganismos que han resultado demostrar su eficacia antagonista ante el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en el control biológico in vitro tras realizarse los experimentos han sido: Trichoderma harzianum y Aspergillus A-5. • En los ensayos realizados, se ha comprobado que la inoculación con Trichoderma harzianum (empleando la dosis de 55 gr/kg como 27.5 gr/kg) estimuló el crecimiento de las plántulas de melón.