Bologna 2007

1. Bologna 2007 Life Learning Center

3. Individuazione della specie carnea

4. Introduzione

5. Procedimento Estrazione e purificazione del DNA PCR Digestione enzimatica dei campioni di carne Elettroforesi post digestione enzimatica dei campioni di carne Analisi dei risultati Applicazioni pratiche Protocollo

6. Estrazione e purificazione del DNA

7. Estrazione e purificazione del DNA

8. PCR

9. Digestione enzimatica dei campioni di carne

10. Elettroforesi post digestione enzimatica dei campioni di carne

16. Applicazioni pratiche Certificazione di accompagnamento ai prodotti in commercio Introduzione di specie alternative Controllo dei semilavorati alimentari

17. Protocollo Omogeneizzazione dei campioni incogniti; Aggiungere 860 �l di tampone di estrazione composto di: > TRIS > EDTA > NaCl > SDS Aggiungere 100 �l di guanidina cloridrato e 40 �l di proteinasi K; Lasciare riposare per 1h a 65�C; Si centrifuga il campione e si prelevano 25 �l della fase liquida contenente il DNA Si aggiungono 250 �l di resina per fissare il DNA tramite i legami dipolo-dipolo.

18. Protocollo Utilizzando una siringa si dissocia la fase solida che contiene il DNA e la resina dalla restante fase liquida Si addizionano 1000 �l di isopropanolo 80% per dissociare il DNA dalla resina Si esegue nuovamente l�operazione del punto precedente quindi si centrifuga il campione La fase liquida viene eluita con acqua distillata (50 �l) e soluzione tampone (50 �l) e quindi si centrifuga

19. Protocollo Aggiungo 3 �l del DNA da amplificare insieme a 22 �l di Master Mix, formato da: > i primer oligonucleotidi che variano a seconda degli esperimenti in base alla fase che si vuole amplificare > basi azotate > Taq � DNA polimerasi > MaCl2 poich� il Ma2+ � indispensabile per l�attivazione della Taq � DNA polimerasi Inserisco la provetta in PCR per 45 cicli Inserire 10 �l di DNA in provette insieme a 2,5 �l di soluzione tampone (buffer per creare ambiente ideale per permettere la digestione degli enzimi) e 2,5 �l di enzima di restrizione ALU Ripetere l�operazione precedente aggiungendo l�enzima di restrizione Hae3 al posto dell�ALU Inserire in una provetta soltanto 10 �l di DNA amplificato Incubare i campioni a 37�C per 60�

20. Protocollo Durante l�attesa preparare un gel al 2% di agarosio e TBE (TRIS, acido borico e EDTA) che si riscalda per ricavarne soluzione omogenea Attraverso l�ausilio di pettini si creano i gel per la successiva elettroforesi Aggiungere ai 25 �l di DNA digerito 5 �l di Loading Dye Aggiungere ai 10 �l di DNA non digerito rimasti 2 �l di Loading Dye

21. Protocollo Caricare nei pozzetti, nell�ordine, 10?l di DNA non digerito, 20 �l di digerito con AluI e 20 �l di digerito con HaeIII. Ricordarsi di annotare lo schema di caricamento Avviare la corsa elettroforetica a 90 V per 30-40' Colorare il gel con etidio bromuro per 1 h circa Fotografare il risultato e confrontare con schemi di raffronto

22. Enzimi di restrizione

26. Trasformazione batterica

27. Introduzione

28. Procedimento Lisi membrana cellulare ed introduzione dei plasmidi Shock termico Incubatura Piastrazione Analisi dei risultati Applicazioni pratiche Protocollo

35. L�organismo cos� modificato e fatto riprodurre costituisce una vera e propria fabbrica di: copie di geni introducibili nel genoma di altri organismi (v. gene resistenza negli OGM e creazione di batteri decompositori di sostanze altrimenti non facilmente decomponibili) copie di proteine di vario utilizzo (insulina, somatostatina, somatotropo, interferone )

36. In campo medico possiamo distinguere quattro tipologie di applicazione: ricerca: utilizzazione di animali geneticamente modificati come cavie (oncotopi: topi modificati che sviluppano determinati tumori, fungono da cavie per le sperimentazione dei farmaci) industria farmaceutica: produzione di vaccini e farmaci prevenzione: analisi del cariotipo, analisi prenatali, analisi dei frammenti di restrizione (RFLP) terapia genica: introduzione di alleli sani nel DNA di individui portatori di alleli patologici

38. Bioetica

39. Enzimi di restrizione

43. Protocollo

48. GFP

49. GFP

50. GFP

55. Bioinformatica

58. I nuclei tematici da noi affrontati sono stati: Individuazione della specie carnea Trasformazione batterica Bioinformatica