A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria

1. A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad, J. M. Silverman, B. B. Ohlson, K. G. Hicks, R. L. Plemel, M. Li, S. Schwarz, W. Y. Wang, A. J. Merz, D. R. Goodlett and Joseph D. Mougous Publié en janvier 2010 Hadj-Saïd Jessica

2. Pseudomonas aeruginosa G - Pathogène opportuniste à large spectre d’hôtes Infections aiguës Infections chroniques patients brulés patients immunodéprimés mucoviscidose Système de sécrétion de type VI (Potvin et al. 2009)

3. HcpSecretion Island-I (II ou III) encoded type VI secretion system HSI-I : pathogénicité de P.aeruginosa (Potvin et al. 2009;Morgous et al. 2006)

4. Système de sécrétion de type VI phosphoryle Fha1-Ƥ PpkA-Ƥ trimère perforation des membranes bactériennes gp5 gp27 (queue du bactériophage) hexamère nanotubes (Ballister, Mougous 2008) H1-SST6 activé déphosphoryle Fha1 H1-SST6 inactivé PppA HCP: HémolysinCoregulatedProtein VgrG: Valine glycine rich G P (Leiman et al. 2009) (Filloux et al. 2008)

5. Objectifs Trouver de nouvelles protéines sécrétées par le H1-T6SS Comparer le sécrétome H1-T6SS fonctionnel (état ouvert) H1-T6SS non fonctionnel (état fermé) Et de les étudier (pathogénicité, cible)

6. Comment caractériser l’état ouvert et l’état fermé de H1-T6SS? vsv-g hcp1 Western Blot révélant Hcp1-V Fusion traductionnelle: P ∆pppAa le H1-T6SS actif (état ON) ∆clpV1 ale H1-T6SS inactif (état OFF)

7. Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa ∆pppA ∆clpV1 H1-T6SS ON H1-T6SS OFF Sécrétomes Spectrométrie de masse Tse1 VgrG1 Tse2 VgrG4 Tse3

8. Deux protéines VgrG sont sécrétées par H1-T6SS OFF ON vsv-g vgrG Western Blot révélant VgrG1-V et VgrG4-V Fusion traductionnelle: OFF ON VgrG sont bien exportées par H1-T6SS Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4

9. Trois protéines Tse1, Tse2, et Tse3 sont sécrétées par H1-T6SS tse vsv-g Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V Fusion traductionnelle: OFF OFF OFF ON ON ON Tse1-3: pas de sécrétion sans Hcp (composants) Tse1-3 sont bien exportées par H1-T6SS

10. Tse1-3 et VgrG: substrats ou composants du H1-T6SS ? OFF ON Western Blot révélant Hcp1-V Sécrétion de Hcp en absence de Tse1-3 Pas de sécrétion de Hcp en absence de VgrG Tse1-3 sont des substrats VgrG1 et VgrG4 sont des composants du H1-T6SS

11. La voie Gac/Rsm est-elle impliquée dans la sécrétion des Tse? Nterm H OFF OFF OFF Cterm ON ON ON Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V D Senseur: GacS RetS P ON ON ON P Régulateur de réponse: GacC L’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et la sécrétion des Tse1-3 Synthèse de RsmZ (ARN non codant) RsmA Tse1-3 toujours sécrétées par le H1-T6SS SST3 Biofilm (GDR Pseudomonas 2008-2011, Patrick Plesiat )

12. Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2 Hyp: locus tse2 tsi2 essentiel pour la viabilité de l’organisme ∆tsi2 Tse2 Tsi2 (-) Vecteur contrôle Inductible à l’IPTG (+) Vecteur avec tse2 tse2 tsi2 protéine toxique Inhibition de la croissance P.aeruginosa protéine d’immunité Type VI SecretionImmunityprotein 2 Tse2 Tsi2 Tse2 seul

13. Interaction des protéines Tse2 et Tsi2 Interaction des protéines Tse2 et Tsi2 Bactérie (culot) Lyse (sonication) ultra Fraction membranaire (culot) Fraction solubles (SN) Cytoplasme + périplasme Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V tsi2-V tse2-GSK tsi2 tse2-GSK tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK

14. Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2 Interaction des protéines Tse2 et Tsi2 Coimmunoprécipitaion de Tsi2-V et Tse2-GSK Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Bille d’agarose couplé à l’Ac anti-VSV-G Tsi2 tsi2-V tse2-GSK tsi2 tse2-GSK Tsi2-V Tse2-GSK Autres protéines Interaction directe entre Tsi2 et Tse2

15. Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes? Cellules eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae DO=0.25 DO=0.13 DO=0.06 DO=0.03 DO=1↔ 4.108cellules.mL-1 DO=0.5 DO=1 L’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies Tse2 intracellulaire a un effet délétère sur les cellules eucaryotes (S. cereviae, HeLa.) Coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau similaire au contrôle

16. Tse2 agit-elle sur les cellules procaryotes? Escherichia coli Burkholderia thailendensis L’expression de tse2 seulinhibe la croissance bactérienne La protéine Tsi2 protège la bactérie de Tse2

17. P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le H1-T6SS? Mesure de la cytotoxicité de différentes souches P.aeruginosa sur des HeLa ∆retS: Tse2 hypersécrétée ∆retS ∆ClpV1 : Tse2 non sécrétée PAO1: Tse2 non sécrétée Haute cytotoxicité Basse cytotoxicité Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS Tse2 n’est pas injectée par le H1-T6SS Tse2 extracellulaire non cytotoxique

18. P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules procaryotes via le H1-T6SS? Expérience de croissance compétitive entre ≠ souches de P.aeruginosa ∆retS: Tse2 hypersécrétée Milieu solide Milieu liquide ∆retS ∆clpV1 ∆retS ∆tse2 ∆retS ∆clpV1 +clpV1 ∆retS ∆retS ∆retS ∆retS Tse2 impacte la croissance de la souche receveuse (dénuée de Tsi2) Tse2 requiert un H1-T6SS fonctionnel Nécessité d’un contact cellulaire donneur-receveur

19. Conclusions VgrG1, VgrG4 sont des composants H1-T6SS Tse1, Tse2 et Tse3 sont des substrats du H1-T6SS L’activation de la voie Gac/Rsm, qui active la formation de biofilm, augmente la quantité des Tse. Tsi2, la protéine d’immunité, permet à l’organisme de se protéger de Tse2 Tse2 intracellulaire inhibe la croissance de cellules eucaryotes et procaryotes H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les cellules eucaryotes H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les souches de Pseudomonas aeruginosasans établir un contact Biofilm

20. Conclusions et Discussions H1-T6SS : mode de communication entre P.aeruginosa H1-T6SS : capacité d’adaptation (fitness) en présence d’autres bactéries. Vie: C’est une P. aeruginosa P.aeruginosa Tse2 Mort: C’était une autre bactérie (Russell & Mougous, juillet 2011) Expression et activation du SST6 sont élevées dans les isolats de patients atteint de mucoviscidose (Yahr, 2006)

21. Cytoplasme Tse2 Membrane interne Cellule bactérienne receveuse Tse3 Pepdidoglycane Tse1 Membrane externe Hcp Modèle hypothétique Membrane externe Tsi1 Cellule bactérienne donneuse Pepdidoglycane Tsi3 Membrane interne Tse2 Tsi2 Cytoplasme Tse3 Tsi2-Tse2 Tse1 VgrG

22. Merci de votre attention