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corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 37-38

corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 37-38. laurea magistrale Biotecnologia Industriale. giovedì 27 Gennaio 2011 aula 6A orario : Martedì ore 14.00 - 16.00 Giovedì ore 13.00 - 15.00. Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo Lezioni fino al 10 Febbraio. D. Frezza.

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  1. corso di Genomica a.a. 2010-2011lezione 37-38 • laurea magistrale Biotecnologia Industriale giovedì 27 Gennaio 2011 aula 6A orario : Martedì ore 14.00 - 16.00 Giovedì ore 13.00 - 15.00 Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo Lezioni fino al 10 Febbraio D. Frezza

  2. cluster Ig topo-uomo (duplicazione) TOR VERGATA Mouse Igh cluster Chromosome 12 mta1 trascrizione JDV 12F1 Human Igh cluster Chromosome 14 mta1 JDV 14q32.33 centromero telomero mta1 crip2 crip1 hole a e g2a g2b g1 g3 d m J D V Em hs 1,2 hs 3A hs 4 hs 3B (cloni instabili) BAC199M11(AF450245) mta1 crip2 crip1 hole a2 e g4 g2 g a1 e g1 g3 d m J D V Em hs 1,2 hs 3 hs 1,2 hs 3 hs 4 hs 4 3’a2 3’a1 IgH3’RR-1 g hs4 hs1.2 hs3 20bp a1 elk 2.1 3’a1 86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,060,000 86,065,000 86,070,000 86,075,000 IgH3’RR-2 hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs3 a2 20bp 3’a2 85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500

  3. Differenti strutture: cosa cambia? Tra topo ed uomo qualcosa cambia ma gli enhancers sono gli stessi Cambia l’architettura, ma non il tipo di funzione - c’è stata una duplicazione, ma i geni (o esoni) delle regioni costanti sono gli stessi, ci sono due catene “alfa” e nel topo ce ne è una sola, - ci sono due regioni regolative con 3 enhancers anziché 4 - resta la regione palindromica

  4. perchè due 3’RR ? sono ridondanti ? U TOR VERGATA se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ? 3 domande + 1: è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ? nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si allevano male) - dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ? - hanno tempi di attivazione diversi? - si attivano e disattivano in fasi diverse della vita del linfocita B?

  5. Confronti RR nei mammiferi

  6. Palindrome interna duplicazione umana duplicazione ma anche inversione dx - sin (speculare)

  7. Confronto specie RR palindrome Panda 13584bp rabbit 14657 mouse 31827 dog 19442

  8. La palindrome servirà a qualcosa ? Stiamo cercando strutture secondarie 3D Ex-post : se c’è servirà Ma in che modo? dalla struttura alla funzione Topi transgenici deleti: delezione completa e delezioni parziali

  9. TOR VERGATA palindrome 3’RR

  10. solo HS1.2 è polimorfica gli enhancer HS3 ed HS4 non sono polimorfici HS1.2 è centrale e sta all’interno di una duplicazione non si conosce molto delle funzioni al di là delle regioni conservate contenenti gli enhancers le regioni intermedie sono poco conservate nelle specie anche all’interno dei mammiferi è possibile studiare le assoociazioni nell’uomo tra polimorfismi, funzioni e patologie

  11. se regola la risposta immunitaria sul topo molti lavori indicano i meccanismi in cui la 3’RR si inserisce: BCR expression, Ig germline transcription, class switch, B cell maturation (molec e cell biol, topi transgenici) nell’uomo lavori di biologia cellulare-molecolare confermano il ruolo importante delle 3’RR, ma sono due invece di una possibili differenze sull’uomo si studiano i polimorfismi non possibili su topo cosa sono i polimorfismi di HS1.2

  12. a centromere chrms 14q32  3 1  2 4  2 E  1 yg TOR VERGATA V j D region HS3 HS1.2 HS4 HS3 HS1.2 HS4 3’RR-1 3’RR-2 Oct1 *1 287 bp EcoRI Sp1 b enhancer HS1,2 *2 NF-B 339 bp alleles *3 393 bp 465 bp *4 Oct1 18mer ---GGCACATGCAAATGG ---GGCACATGCAAATGG ---GGCACATGCAAATGG ---GGCACATGCAAATGG CCCCCCGCCCCCTCCCCC---------------------------------------------------------------------------------------------------------- CCCCCCGCCCCCTCCCCC---------------------------------------------------------------------------------------------------------- CCCCCCGCCCCCTCCCCC---------------------------------------------------------------------------------------------------------- CTTGCACGATT CTTGCACGATT CTTGCACGATT AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGA CTCCACCTGCAGCTGCAGCCGCCACCCACCC CTTGCACGATT 29mer NF-B core 40mer Sp1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC ------------------------------------------- alleles AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC CCCCCCCCCCCCAAC CACCCCCCGCCCCCTCCCCC CCCCCCCCCCCCAAC AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA 18mer NF-B 40mer 15mer 40mer NF-B Sp1 NF-B --------------------------------------------------------- AGGACA AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA CCCCCCGCCCCCTCCCCC CAGG CACCCCCCCACCAC AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA CAGG CCCCCCGCCCCCTCCCCC AGGACA CTCCAGATTCGGGGA CACCCCCCCACCAC AGGACA CAGG CCCCCCGCCCCCTCCCCC CTCCAGATTCGGGGA AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA CACCCCCCCACCAC CAGG AGGACA AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA CCCCCCGCCCCCTCCCCC CTCCAGATTCGGGGACA 12mer 40mer 18mer End polimorfismo HS1.2 umana *1 *1 *1 *2 *2 *2 *3 *3 *3 *4 *4 *4

  13. i polimorfismi TOR VERGATA H* H B E E B H B B B B 4420 bp EcoRI HS1,2 P3Frw EcoRI D3Rev Core of enhancer HS1,2 14bp 16bp 20bp A B Selective amplification of HS1,2-B downstream Ca2 (IgH3’RR-2) Selective amplification of HS1,2-A downstream Ca1 (IgH3’RR-1) Poly A site Poly A site B H B HS 3 HS 3 U8 r U7r R3 R3 R3r Ub2 U5 U1 R1 Ub1 R3 R3 r Ua1 U5 U8 U1 U3 2m U2 U6 U4-5 U6r U5r R4 U4 U6 U7 1m R1 R2 UU 3 4 HS 1,2 U2 HS 1,2 SA2.5 5402 bp HS1,2 HS 3 HS1,2 A2R SA2.5 A2R A2F EcoRI HS1,2 ALLELE 1A D3Rev P3Frw EcoRI ALLELE 2A EcoRI ALLELE 3B ALLELE 3A EcoRI ALLELE 4B ALLELE 4A Repeated element - 38 bp Internal spacers External element - 31 bp External element -17 bp Conserved sequence Unit

  14. TOR VERGATA ALLELE *2A 339 Sites for : AP4; E47; MYOD; mE5 Sites for : CMYB Sites for : SP1; IK2; MZF1 Sites for : NF-kB 6 alleli Figure 3 polymorphism of HS1,2A CORE enhancer 17bp El. 38bp Rp 17bp El. END HS1,2 287 ALLELE *1A 14bp Sp. 31bp El 20bp Sp. ALLELE *2B 360 16bp Sp. 17bp El 14bp Sp 393 ALLELE *3A 31bp El 20bp Sp 414 ALLELE *3B 20bp Sp. 31bp El 20bp Sp ALLELE *4 472 Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)

  15. Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’ enhancer HS1,2 and its relation to gene expression U TOR VERGATA Immunology 2001, 103: 35-40

  16. TOR VERGATA Symergic effects synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4 HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (g2b, g3, a,e) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific manner. (Ong et al, 1998)

  17. IgH3’RR-1 TOR VERGATA SA2.5 A2R Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 H* H B E B B B H B H H U 14 U9 1 R4 R6 Ua1 U3 U5 R3 R3r U5r Ua4 R5 Alu LTR ELK2 U1 R1 R2 U4 U6 U7 U8 U6r Ua2 Ua3 R5 U11 U12 U16 U13 K10 retrovirus U15 Ua5 U10 U2 A HS3 HS1,2 HS4 clone CHR77 (35.616 kb) Chromosome 14  4  2 1  1 2 3 centromero   IgH3’RR-2 B SF AL928742 (40 kb) Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 H H B B H B E B B H U9 Ub4 R6 Alu LTR 2 R1 U6r R4 Ub3 R5 Ub1 Ub2 R3 U 8r U5 U4-5 U 3 U13 U14 U15 U16 U2 U4 U7 U10 U11 U12 R3r R5 U1 U7r U5r R3 U6 HS3 HS1,2 HS4 SA2.5 A2R A2F

  18. gel genomico e selettivo degli alleli U CM11 CM 4 CM 5 TOR VERGATA ALLELE 1 ALLELE 4 ALLELE 3 ALLELE 2 M1 M2 G RR-1 RR-2 G RR-1 RR-2 G RR-1 RR-2 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp amplificazione G=genomica o selettiva RR-1; RR-2 nell’amplificazione genomica si vedono gli alleli delle 2 regioni senza PCR selettiva applicata invece per amplificare selettivamente A o B.

  19. allele *2a allele *2b i due alleli *2a, *2b e *3a, *3B amplificazioni da DNA genomico dalle due 3’RR senza selezione allele *4 465 bp allele *3 393 bp 360 bp 339 bp allele *1 287 bp avevamo visto che nel locus 3’RR-B l’allele *3 aveva l’elemento 31mer rispetto al 17mer del locus 3’RR-A adesso abbiamo (ho) visto che anche l’allele *2 esiste nelle due forme con il 17mer ed il 31mer, cambiano le consensus!

  20. U TOR VERGATA allineamenti Evoluzione di HS1,2 in diverse specie di mammifero e di primati il core dell’enhancer è più conservata (rosa) ed il 31mer (arancio) potrebbe essere la forma ancestrale stiamo cercando di clonare le forme polimorfiche di altre specie (topo macaco, scimpanzè) per confrontare la funzionalità in cellule di topo e uomo

  21. conservazione in altre specie Homo s.; Gorilla; Orango; Homo s. allele 4;Cavia; Macaca; Callitrix; Canis; Equus; Felis; Pteropus; Rattus; Mus; Bos; Sus; Callicebus; Monodelphis (opossum);Capra; Gallus.

  22. platirrine - catarrine 40 Mya

  23. evoluzione della IgH 3’RR

  24. strutture conservate di HS1.2 manca la sequenza di Panda uscita il 13 Dicembre 2009

  25. TOR VERGATA evoluzione di HS1.2

  26. quali altre analisi ? • il polimorfismo si può studiare dal punto di vista funzionale • struttura e modelli in “silicio” (transcr. fact.; 3D models) • CHIP chromosome immuno-precipitation • EMSA electrophoretic mobility shift assay: • incubazione della sonda con le consensus con estratti nucleari • corsa elettroforetica • competizione con anticorpi o con consensus che sottraggono la formazione del complesso e fanno sparire il segnale

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