Cursul V

1. Cursul V Antioxidanţi ne-enzimatici

2. VITAMINA C • Antioxidant important şi puternic, care acţionează în mediu apos

4. La pH fiziologic 99,9% din vitamina C este prezentă ca AscH- şi numai 0,05% ca AscH2 şi0,04% caAsc- • AscH- este un antioxidant donor şi reacţionează cu radicali formând radicali liberi ascorbat stabilizaţi prin rezonanţă • Produsul oxidării ascorbatului de către ROS este radicalul semidehidroascorbat care este considerat o moleculă antioxidantă mică, al cărui nivel este o măsură a gradului de stres oxidativ în sistemele biologice

5. Doze mari de vit C (până la 2000mg/zi) nu produc efecte secundare • Nivele serice scăzute în populaţia cu risc crescut pot contribui la un risc crescut de metaplazie gastrică şi gastrită cronică, care sunt leziuni precanceroase • Efectul pozitiv în reducerea incidenţei cancerului de stomac se datoreşte, probabil, acţiunii inhibitoare în generarea compuşilor N-nitrozilaţi prin inhibiţia reacţiei dintre nitriţi şi grupări amino • Efect protector consistent în cancerul de plămân şi colorectal

6. Efectul pro-oxidant al ascorbatului a fost atribuit eliberării ionilor metalici din celulele lezate • Vit C induce descompunerea hidroperoxizilor lipidici cu formare de electrofili bifuncţionali ce pot reacţiona cu ADN: 4-oxo-2nonenal, 4,5-epoxi-2-decenal şi 4-hidroxi-2-nonenal. • 4,5-epoxi-2-decenal este precursor al eteno-2’-deoxiadenozina, care corespunde unei leziuni înalt mutagenice de la nivelul ADN uman • În condiţii nefiziologice, vit C promovează formarea radicalilor hidroxil dependentă de ioni metalici

7. Studii in vitro au dovedit că vit C inhibă peroxidarea lipidică dependentă de metale tranziţionale (Fe, Cu) în plasmă şi alte fluide biologice • Produce o reducere a markerilor de oxidare a ADN, a lipidelor şi proteinelor • În prezenţa fierului, reduce lezarea oxidativă • Rol anti-apoptotic şi de modulare a sistemului imun • Celulele tratate cu ascorbat expuse la iradiere UV-B au prezentat o descreştere cu 50% a fosforilării JNK (care activează AP-1), ceea ce inhibă calea de semnalizare JNK/AP-1.

8. Vitamina E • Este liposolubilă şi există în 8 forme diferite • Alfa-tocoferolul este cea mai activă formă de vit E la oameni şi cel mai puternic antioxidant biologic, legat de membrană, folosit de celulă • Asigură protecţia împotriva peroxidării lipidice

9. Alfa-tocoferolul şi acidul ascorbic funcţionează într-un proces ciclic: alfa-tocoferolul este convertit în radical alfa-tocoferil prin donarea unui hidrogen labil unui lipid sau unui radical peroxil lipidic. Acest radical poate fi redus la alfa-tocoferol de către acidul ascorbic. • Aportul de vit E reduce incidenţa cancerului colorectal prin declanşarea apoptozei în celulele canceroase prin inducerea unui inhibitor puternic al ciclului celular p21wafi/cip1 • Vit E inhibă formarea ROS şi activarea endonucleazelor • Doze de 400 UI/zi sau mai mari pot creşte riscul letal

10. Antioxidanţii tiolici-Glutationul

11. NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH • Este tamponul redox principal tiol-disulfură din celule • În citosol (1-11 mM), în mitocondrie (5-11mM), în nucleu (3-15 mM) • GSH din nucleu menţin grupările sulfhidril ale proteinelor ce sunt necesare reparării ADN şi expresiei acesteia • Capacitatea antioxidantă a compuşilor tiolici se datoreşte atomului de sulf care poate pierde uşor un electron

13. Raportul GSH/GSSG este o bună măsură a stresului oxidativ a unui organism. Disulfura mixtă, proteină-SSG, au un half life mai mare decât GSSG, probabil datorită plierii proteinelor

14. Rolurile GSH împotriva stresului oxidativ • Este substrat al mai multor enzime de detoxifiere: GPx, GST • Participă la transportul aminoacizilor prin membrana plasmatică • Inactivează radicalul hidroxil şi oxigenul singlet direct, detoxifiind peroxidul de hidrogen şi peroxizii lipidici prin acţiunea catalitică a GPx • Regenerează vit C şi E

16. Capacitatea glutationului de a regenera cei mai importanţi antioxidanţi este legată de raportul GSSG/2GSH, care are un impact mare asupra mediului redox total al celulei. • Potenţialul de reducere al acestui cuplu depinde de mediul redox în care funcţionează. • Potenţialul redox este -180mV în reticulul endoplasmatic şi • -232 mV în citosol. Acest potenţial nu depinde numai de raportul GSSG/2GSH ci şi de valoarea absolută a concentraţiei GSH (în funcţie de balanţa între sinteză şi utilizare). • Expunerea la ROS determină creşterea concentraţiei GSH prin creşterea vitezei de sinteză a GSH. • HNE creşte viteza de sinteză a GSH • HNE activează JNK, care activează AP-1

17. GSH protejază celulele împotriva apoptozei prin aceea că modulează starea redox a celulei şi interacţionează cu semnalele pro- şi anti-apoptotice De aceea o serie de medicamente anticancer determină depleţia în GSH O serie de tipuri de cancer sunt asociate cu alterarea funcţionării unor enzime care acţionează în prezenţa glutationului (de ex. GST). GST catalizează conjugarea glutationului cu o serie de compuşi lipofili: carcinogeni, medicamnte, produşi de stres oxidativ.

18. Există 5 clase de GST: alfa, miu, pi, gama şi teta Clasa miu este reprezentată de 5 izoenzime diferite: M1-M5 Cele mai multe mutaţii apar la GST M1 În sângele pacienţilor de cancer de sân şi colon raportul GSH/GSSG este descrescut comparativ cu martorul, pentru că nivelul GSSG creşte în primele stadii ale progresiei tumorale, datorită generării de peroxid.

19. Antioxidanţi tiolici-sistemul tioredoxinei • Tioredoxina (TRX) este o proteină mică, multifuncţională, cu funcţii redox ce conţine două resturi de cisteină active redox la un situs activ conservat:Cys-Gly-Pro-Cys • Tioredoxina conţine două grupări –SH adiacente, care sunt convertite la o legătură disulfurică în tioredoxina oxidată, care suferă reacţii redox cu proteine multiple

20. Reducerea legăturii disulfurice la puntea disulfurică este catalizată de tioredoxin reductază (TR), sursa de electroni fiind NADPH

21. Tioredoxina controlează un număr de factori de transcripţie ce afectează proliferarea celulară şi moartea prin mecanismul de reglare redox. • TRX este prezentă în concentraţii de 100-1000 mai mici decât GSH, iar cei doi compuşi au funcţii suprapuse şi compartimentalizate în activarea şi reglarea factorilor de transcriere (ca de ex. NF-kB şi AP_1). • Mecanismul de funcţionare: • TRX este redusă la situsul său activ de către TR(SH)2 • TRX intră în nucleu pentru a regla activitatea factorilor de transcripţie • TRX este excretată afară din celulă unde acţionează asupra altor factori de creştere

22. TRX: • Inhibă activitatea NF-kB în citoplasmă • Stimulează abilitatea NF-kB de a se lega ADN în nucleu • Poate regla HIF-1 şi cyt 450 • Se translocă din citosol în nucleu ca răspuns la stresul oxidativ pentru a regla expresia genică prin Ref-1 • Reglează activitatea p53

23. IMPLICAŢII ÎN CANCER • Nivele ridicate de TRX apar în carcinom cervical, hepatom, tumori gastrice, carcinoame de plămân şi colorectal • O serie de celule canceroase secretă TRX • TRX stimulează dezvoltarea unor linii celulare leucemice şi derivate de la tumori solide • Supraexpresia TRX protejază celulele împotriva apoptozei induse de stres oxidativ şi favorizează creşterea tumorilor • Nivele ridicate de TRX în tumorile umane determină rezistenţa la chimioterapie

24. Antioxidanţi tiolici-Acidul lipoic

25. Acidul lipoic=acid tioctic • Are natură amfifilică şi este distribuit atât în membrane cât şi în citosol • Este absorbit rapid din dietă • Are funcţii antioxidante: • Stinge ROS • Regenerează antioxidanţi endogeni şi exogeni: vit C, E şi GSH • Chelatarea metalelor redox (Cu (II), Fe(II), etc) • Repară proteinele oxidate

26. Acidul lipoic: • Previne distrugerea celulelor beta-pancreatice, stimulează preluarea glucozei, protejază împotriva aterosclerozei şi cataractei şi descreşte amploarea neuropatiei diabetice • Are efecte radioprotective; la Cernobîl după dezastrul nuclear, a redus efectele nocive în ficatul şi rinichii copiilor afectaţi • Este eficient în tratamentul otrăvirii cu metale grele

27. Carotenoizii • Pigmenţi din plante şi microorganisme • Peste 600 în natură

28. Capacitatea antioxidantă a carotenoizilor se datoreşte abilităţii structurii cu duble legături conjugate să favorizeze delocalizarea electronilor neîmperecheaţi. • De aceea beta-carotenul • anihilează oxigenul singlet • Reacţionează cu radicalii peroxil, hidroxil şi superoxid • La concentraţii suficient de mari, inhibă peroxidarea lipidelor

29. Mecanisme propuse pentru reacţia carotenilor cu radicalii liberi: • Adiţia radicalică • Extragerea hidrogenului din carotenoizi • Reacţia de transfer de electroni • Formarea unui aduct

30. Beta-carotenul poate participa la peroxidarea lipidelor ca pro-oxidant: • Testul alfa-tocoferol-beta-caroten (US National Cancer Institute) • In Finlanda, 29133 subiecţi bărbaţi fumători între 50-69 ani • 20mg/zi beta-caroten timp de 5-8 ani • A crescut cu 18% incidenţa cancerului pulmonar şi cu 8% mortalitatea la lotul tratat comparativ cu cel martor • Factorul cheie care permite trecerea de la funcţia de antioxidant la cea de pro-oxidant este presiunea parţială de oxigen

31. Radicalul caroten-peroxil determină oxidarea lipidelor nesaturate La presiuni parţiale de oxigen sub 150 Torr, carotenii îşi manifestă proprietăţile antioxidante iar la presiuni mai mari devin pro-oxidanţi. La fel se întâmplă şi la concentraţii mari.

32. Acidul retinoic inhibă proliferarea celulară şi creşte diferenţierea celulară Licopenul inhibă progresia ciclului celular în liniile celulare canceroase de sân, plămân şi prostată Carotenii au rol anti-inflamator, inhibând producerea de IL-6 şi TNF-alfa În celule sănătoase inhibă expresia de Bax şi o stimulează pe cea a Bcl-2 Beta-carotenul inhibă expresia Bcl-2 în celulele canceroase Beta-carotenul are efect pro-apoptotic prin creşterea ROS şi a GSSG/GSH, corelat cu creşterea capacităţii de legare a NF-kB în celule de cancer de colon şi leucemice

33. FLAVONOIDELE • Compuşi polifenolici ce sunt prezenţi în dieta umană • Circa 4000 compuşi descrişi împărţiţi în 13 clase • Au o structură difenil propanică: 2 cicluri aromatice legate prin 3 atomi de carbon implicaţi într-un heterociclu cu oxigen

35. Roluri în sănătatea umană: • Tratamentul şi prevenţia cancerului • Tratamentul şi prevenţia bolilor cardiovasculare • Tratamentul şi prevenţia altor patologii

36. Compuşii fenolici: • Terminatori ai lanţurilor de radicali liberi • Chelatează ionii metalici redoxactivi • Interferă cu peroxizii lipidici, generând radicali fenoxil, care sunt relativ stabili şi nu propagă reacţii radicalice în lanţ !!! Concentraţii mari, prezenţa metalelor redox active şi valori mari de pH, generează un efect pro-oxidant

37. Flavonoidele sunt scavengeri ideali pentru radicalii peroxildatorită potenţialului de reducere favorabil în raport cu radicalii alchil-peroxil. Au capacitatea de a dona un proton şi un electron unui radical datorită inelului B catecol Au efect antioxidant şi datorită prezenţei nesaturării 2,3 în conjugare cu gruparea oxo din poz 4 a inelului C Grupările hidroxil din poziţiile din inele A şi B au rol în capacitatea flavonoidelor de a chelata metalele redox active şi de a împiedica reacţiile Fenton

38. Aportul regulat de flavonoide: • Corelat cu rate scăzute de cancer de stomac, pancreas, plămân şi sân • Quercetina previne formarea trombilor şi blocarea arterelor, reducând incidenţa infarctelor şi al accidentelor vasculare cerebrale

39. Seleniu • Asociat GPx şi TR • Selenoenzimele joacă un rol în controlul diviziunii celulare, metabolismul oxigenului, procesele de detoxifiere, inducerea apoptozei în celulele canceroase şi funcţionarea sistemului imun • Nivelele de Se şi GPx de la pacientele de cancer cervical sunt scăzute • Un aport de 200 microg/zi nu a redus riscul de cancer de piele, dar a redus riscul de metastaze la cancerele de plămân, colon şi prostată (SUA) • Un aport de 50 microg/zi plus alfa-tocoferol şi beta-caroten a redus semnificativ rata mortalităţii de cancer de stomac (China)

40. Seleniul: • Reduce lezarea ADN indusă de stres oxidativ şi formarea de aducţi ADN-carcinogen legaţi covalent • Induce expresia p53 • Administrarea de acid metilselenic a dus la inhibiţia creşterii unor linii celulare pre-maligne de cancer de sân

41. Stresul oxidativ şi mediul redox celular • Fiecare celulă prezintă o concentraţie particulară de electroni păstrată la nivelul multor constituenţi celulari. • Oscilaţiile stării redox a celulei determină diferenţierea celulară • În condiţii normale, starea redox celulară variază într-un domeniu foarte strâns, ca şi pH; în condiţii patologice, starea redox poate căpăta valori mai mari sau mai mici faţă de normal • Capacitatea de tamponare redox este asigurată în primul rând de GSH şi TRX • Conc. intracelulară de GSH este de 500 ori mai mare decât cea extracelulară

42. Raportul 2GSH/GSSGestetradus înproces de semnalizare redox • REG este un micromediu oxidativ, în care raportul este relativ scăzut iar formarea punţilor disulfurice este un aspect important al plierii proteinelor • În condiţii de stres oxidativ se formează GSSG şi disulfuri proteice mixte; unii receptori, protein kinaze şi factori de transcripţie care au grupări tiol critice pentru activitatea lor, pot reacţiona cu GSSG formând disulfuri mixte, ceea ce afectează funcţia biologică • GSSG poate acţiona ca o moleculă semnal nespecifică

43. Nivele ridicate de GSH şi TRX sunt asigurate în celulă de glutation reductază şi tioredoxin reductază • Mediul redox celular joacă un rol important în: • Traducerea de semnale • Activarea enzimelor • Sinteza ADN şi ARN • Proliferare celulară • Diferenţiere celulară • Apoptoză

44. În general: • Moartea celulară este produsă de un mediu celular oxidativ • Proliferarea este produsă de un mediu celular reducător

45. Ciclul celular este caracterizat de fluctuaţii în mediul redox extracelular, mediate în primul rând prin modificările intracelulare ale concentraţiei de GSH În exteriorul celulei se găsesc molecule oxidante ca peroxidul de hidrogen, tioredoxina, care sunt transportate prin membrana plasmatică şi modifică mediul redox intracelular Un mediu celular foarte reducător stimulează proliferarea celulară, o uşoară trecere spre un mediu mai oxidativ determină diferenţierea celulară Cînd mediul intracelular devine mult mai oxidat, se produce moartea celulară: apoptoza şi necroza Apoptoza este indusă de stimuli oxidativi moderaţi iar necroza de un mediu oxidativ intens.

47. În diferite tipuri de linii celulare concentraţii de 5-35 µM peroxid de hidrogen au generat apoptoză, iar necroza a fost indusă la 100µM. În celulele canceroase, balanţa redox este perturbată. Un nivel al potenţialului reducător ridicat în nucleu şi mitocondrii , realizat prin menţinerea unor concentraţii ridicate de GSH şi TRX facilitează eludarea apoptozei şi determină un potenţial proliferativ prin activarea semnalelor de supravieţuire celulară mediate de factoriide transcripţie nucleari redox-sensibili

48. Enzima de reparare a ADN APE/Ref-1 este o proteină cu funcţie duală care joacă un rol important în răspunsul transcripţional la stres oxidativ şi în repararea prin excizia bazelor a ADN. • Facilitează legarea la ADN a mai multor factori de transcripţie: AP-1, p53, NF-kB prin mecanisme redox dependente şi independente • Supraexpresia Ref 1 protejază celulele de stimuli apoptotici: stres oxidativ şi radiaţii • Scăderea expresiei Ref 1 este corelată cu apoptoza • Ref1 este implicat în diferite stadii ale carcinogenezei (iniţiere, promovare şi progresie) prin: • Menţinerea balanţei redox intracelulare • Activarea unui semnal de supravieţuirii • Repararea leziunilor la nivel ADN

49. Nivele ridicate ale Ref-1: • Cancer de prostată • Cancer cervical • Cancer ovarian Ref-1 prezintă activităţi enzimatice la nivel citoplasmatic şi nuclear