1 / 16

枯草菌 C 4 - ジカルボン酸輸送体 DctP と MaeN の機能解析

枯草菌 C 4 - ジカルボン酸輸送体 DctP と MaeN の機能解析. 理工学研究科分子生物学専攻 指導教官： 大西 純一 生内 寿文. 枯草菌と大腸菌の TCA 回路代謝中間産物の輸送体. Bastiaan P. Korm et al . Antonie Van Leeuwenhoek. 2003; 84(1): 69-80. より一部改. 枯草菌の C 4 - ジカルボン酸取り込み に関する2つの経路. 第一経路. 第二経路. Succinate. Fumarate. Malate. ?. DctP. MaeN. ?. DctS. YufL.

iona-cleveland
Download Presentation

枯草菌 C 4 - ジカルボン酸輸送体 DctP と MaeN の機能解析

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 枯草菌C4-ジカルボン酸輸送体DctPとMaeNの機能解析枯草菌C4-ジカルボン酸輸送体DctPとMaeNの機能解析 理工学研究科分子生物学専攻 指導教官： 大西 純一 生内 寿文

  2. 枯草菌と大腸菌のTCA回路代謝中間産物の輸送体枯草菌と大腸菌のTCA回路代謝中間産物の輸送体 Bastiaan P. Korm et al. Antonie Van Leeuwenhoek. 2003; 84(1): 69-80. より一部改

  3. 枯草菌のC4-ジカルボン酸取り込みに関する2つの経路枯草菌のC4-ジカルボン酸取り込みに関する2つの経路 第一経路 第二経路 Succinate Fumarate Malate ? DctP MaeN ? DctS YufL DctB YufM ? DctR P P YufL DctS DctR YufM P P dctP maeN

  4. DctPとMaeNについてのこれまでの実験

  5. 最小培地でのdctA欠損大腸菌株の生育の変化①pDctPで形質転換最小培地でのdctA欠損大腸菌株の生育の変化①pDctPで形質転換 〇野生株◇dctA欠損株　◆dctA欠損株 pDctP

  6. dctA欠損大腸菌株の14C-コハク酸取り込み活性 大腸菌を培養 （pDctP保持株はDctPを誘導発現） 　　　　　↓ 集菌してリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁 　　　　　↓ 大腸菌懸濁液に1 mM 14C-コハク酸 を加え，氷上でインキュベーションし てその取り込み活性を測定

  7. DctP発現DctA欠損大腸菌株の拮抗阻害剤存在下での14C-コハク酸取り込みDctP発現DctA欠損大腸菌株の拮抗阻害剤存在下での14C-コハク酸取り込み

  8. dctA欠損大腸菌株の14C-リンゴ酸取り込み活性 大腸菌を培養 （プラスミド保持株はそれぞれの 　タンパク質を誘導発現） 　　　　　↓ 集菌してリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁 　　　　　↓ 大腸菌懸濁液に1 mM 14C-リンゴ酸 を加え，氷上でインキュベーションし てその取り込み活性を測定

  9. DctP発現dctA欠損大腸菌株の14C-リンゴ酸輸送の速度論的解析DctP発現dctA欠損大腸菌株の14C-リンゴ酸輸送の速度論的解析

  10. 最小培地でのdctA欠損大腸菌株の生育の変化②pMaeNで形質転換最小培地でのdctA欠損大腸菌株の生育の変化②pMaeNで形質転換

  11. dctA欠損大腸菌株の14C-リンゴ酸取り込み活性 大腸菌を培養 （プラスミド保持株はそれぞれの 　タンパク質を誘導発現） 　　　　　↓ 集菌してリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁 　　　　　↓ 大腸菌懸濁液に1 mM 14C-リンゴ酸 を加え，氷上でインキュベーションし てその取り込み活性を測定

  12. MaeN発現大腸菌株の14C-リンゴ酸取り込みのpH依存性MaeN発現大腸菌株の14C-リンゴ酸取り込みのpH依存性 大腸菌を培養 （プラスミド保持株はそれぞれの 　タンパク質を誘導発現） 　　　　　↓ 集菌してリン酸緩衝液（pH 5-9） に懸濁 　　　　　↓ 大腸菌懸濁液に20 µM 14C-リンゴ酸 を加え，氷上でインキュベーションし てその取り込み活性を測定

  13. DctPとMaeNについて本実験により明らかになった事実DctPとMaeNについて本実験により明らかになった事実

  14. dctPとmaeNのプロモーター活性測定 栄養培地で枯草菌を前培養 　　　　↓ 0-5 mM リンゴ酸を含む最小培地 で枯草菌を本培養 　　　　↓ OD600 = 0.5で集菌して b-Galactosidase活性を測定 Malate DctP DctP MaeN 第一経路 第一・第二経路

  15. まとめ • DctPの輸送基質はコハク酸，フマル酸，リンゴ酸とアスパラギン酸などC4-ジカルボン酸を広く輸送基質とする． • DctPは枯草菌のC4-ジカルボン酸取り込みにおける第一経路の輸送体である事が示された． • MaeNはNa+/Malate共輸送体と考えられているが，大腸菌内では外液のpHが酸性条件で輸送活性が検出された．

  16. 謝辞 松本 幸次　先生 朝井　計　先生 小笠原直毅　先生　 （奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科） 細胞生化学研究室の皆様 本研究を進めるにあたってお世話になりました 上記の人々に深く感謝いたします

More Related