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Tetrahymena. Etudes de protéines durant un stress toxique par immunodétection. Buts à long terme. Comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux produits toxiques, chocs oxydatifs et autres "stress chimiques" Trouver des marqueurs potentiels de toxicité

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Tetrahymena

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Presentation Transcript


Tetrahymena

Etudes de protéines durant un stress toxique par immunodétection


Buts à long terme

  • Comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux produits toxiques, chocs oxydatifs et autres "stress chimiques"

  • Trouver des marqueurs potentiels de toxicité

    • Evaluation de la qualité de l'eau

    • Evaluation de la toxicité de produits chimiques

    • QSAR


Objectifs du projet

  • Identifier la protéine 32 k par immunodétection

  • Déterminer les paramètres d'induction de cette protéine

    • Cinétique

    • Concentration de toxique

    • Type de toxiques

    • Synergie

    • Etc.


Objectifs du projet (alternatives)

  • Identification par PCR

    • Identifier gène dans génome Tetrahymena

    • Définir sonde spécifique

    • Obtenir sonde

    • Développer protocole

    • Résultat négatif => ????


Culture des cellules…

  • Culture stock

  • Culture de conditionnement

  • Culture de travail

  • Incubations


Traitements…

  • Contrôle

  • Choc thermique

  • Toxiques/stress

    • Concentration, durée, cinétique

    • Toxiques, Stress oxydatif, inhibiteurs


Incubations…

  • 2.5 x 105 cell/mL

  • Volume total : 1 mL

  • Durée: 45 min

  • Milieu culture:

  • Contrôle:

    • Aucun toxique = -

    • 34°C (choc thermique) = +


Extraction des protéines…

  • SDS ou phénol


Electrophorèse…

  • Système de Laemlli (SDS)

  • Gels 5%/12.6%

  • Electrobuvardage

    • Semi-sec

    • Nitrocellulose ou PVDF


Immunodétection

  • Ab secondaire conjugué phosphatase alc.

  • Détection chromogénique ou chémifluorescence

  • Etalons:

  • Contrôle interne: actine

  • Ag: actine, 32k (rat),


Autres protéines intéressantes

  • Métallothioénine

  • GRP76

  • HSP….


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