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实验七 鸡基因组的 PCR-RFLP 分析. 动物遗传学实验. 一、实验方法 1 、鸡基因组 DNA 的提取 2 、目的基因的 PCR 扩增 3 、内切酶消化 PCR 产物 4 、琼脂糖凝胶电泳(检测基因型). 鸡 DNA 的获取 1 、鸡翅下静脉采集全血; 2%EDTA 抗凝; 2 、 DNA 提取: 裂解细胞核(红细胞 + 白细胞) 酚 - 氯仿去除蛋白质 酶解 RNA 获取 DNA. PCR 扩增 1 、引物设计( Genbank ); 2 、聚合酶链反应( polymerase chain reaction , PCR ).
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实验七 鸡基因组的PCR-RFLP分析 动物遗传学实验
一、实验方法 1、鸡基因组DNA的提取 2、目的基因的PCR扩增 3、内切酶消化PCR产物 4、琼脂糖凝胶电泳(检测基因型)
鸡DNA的获取 1、鸡翅下静脉采集全血;2%EDTA抗凝; 2、DNA提取: 裂解细胞核(红细胞+白细胞) 酚-氯仿去除蛋白质 酶解RNA 获取DNA
PCR扩增 1、引物设计(Genbank); 2、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
PCR反应体系 DNA模板 dNTP Taq DNA聚合酶 引物 Mg2+ 缓冲液
PCR反应程序 预变性 94℃ 3~5min 35循环: 变性 94 ℃ 30s~1min 退火 50~65 ℃ 30~60s 延伸 72 ℃ 1~2min 后延伸 72 ℃ 5~10min
内切酶消化PCR产物 PCR产物+缓冲液+内切酶 5‘-TCATGA-3’ 3’-AGTACT-5’
电泳检测基因(1) A B 电泳图谱 AA BB AB
实际操作环节 琼脂糖凝胶电泳检测基因型
二、实验原理 • 电荷效应:DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。 • 分子筛效应:与分子大小及构象有关,由于DNA分子或DNA片段的分子量差别,电泳后呈现迁移位置的差异。 • 条带类型对应于基因型。
三、实验目的 通过此实验操作,掌握琼脂糖凝胶电泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判定方法。
四、实验材料、仪器和试剂 • 材料:DNA样品 • 仪器:电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、Tip头 • 试剂 • 电泳缓冲液(1×TAE):0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷-乙酸(tris-乙酸),0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA) • 溴化乙锭(EB10mg/ml):100ml灭菌双蒸水中加入1g EB • 1%琼脂糖:100ml 1×TAE加入1g琼脂糖 • 上样缓冲液(溴酚蓝-甘油溶液):先配制1%的溴酚蓝水溶液与等体积的甘油即可
(一)制胶 1.将1.0g琼脂糖加至100 ml 1×TAE缓冲液中,配成1%琼脂糖。琼脂糖在微波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至60。C以下。 2.加入5ul溴化乙锭(终浓度0.5ug/ ml )至熔化的琼脂糖液中混匀,但避免出现气泡。 3.准备好凝胶成型器。 4.将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器,制备凝胶。 5.在凝胶一侧放入成型梳,将梳子夹在胶上方的桥上,并保证梳齿在塑料板稍上一点,但不要接触塑料板。 6.待胶变硬,直到它呈乳白状且不透明(约20分钟),轻轻去除梳子。配制2L 1×TAE缓冲液,用于电泳槽。将缓冲液到入洁净的凝胶槽。
(二)电泳 1.将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。 2.凝胶应完全侵入缓冲液,但覆盖的缓冲液不要超过1cm。 3.取5ul样品加入上样缓冲液,小心的将样品加入每一样品槽内 4.接通电源,电压4-5V/cm,DNA从负极移到正极。时间30-40分钟。 5.关掉电源,结束电泳。
六、结果分析 1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间 2.开通紫外光,在电脑中观察图像; 3.关上紫外光电源,在电脑中编辑和保存图像; 4.根据图像结果判定不同个体基因型。
七、作业 1.记录实验结果 2.实验心得 3.鸡生长激素基因经MspI处理后电泳出现6种带型(下图),对应于6种基因型,序列分析显示其受3个等位基因A、B、C控制,请判断1~6的基因型