Regulacja ekspresji transgenu w roślinach

1. Regulacja ekspresji transgenu wroślinach Anna Śledzińska Ewa Skotnicka

2. Części składowe transgenu • promotor podstawowy • TATA box • sekwencja Inr • element dpe (downstream promoter element) • wzmacniacze (enhancer) • wyciszacze (silencer) • sekwencja liderowa (5’UTR) • wzmacniacze translacji np. z wirusa AMV • sekwencja Kozak – 5’-ACCAUGG-3’ , zawiera kodon inicjacji translacji

3. Części składowe transgenu c.d.n. • wprowadzony gen • miejsce poliadenylacji w regionie 3’UTR (często pochodzi z genu syntazy oktopiny) – oddziaływuje z regionem 5’UTR podczas inicjacji translacji

4. „Transgene expression and control” B. Miki Eastern Cereal and Oil Research Center

5. Promotory genów konstytutywnych CaMV 35 S nos ocs Promotory enzymów tkankowo specyficznych fazeoliny gluteniny α-amylazy Pochodzenie Wirus mozaiki kalafiora Syntaza nopaliny (T-DNA) Syntaza oktopiny (T-DNA) Miejsce ekspresji genu liścienie bielmo warstwa aleuronowa Najczęściej stosowane promotory

6. Rośliny zakażone wirusem mozaiki kalafiorowej Source: Institut National de la echercheAgronomique, Versailles-Grignon

7. Zwiększanie ekspresji transgenu • usunięcie kryptycznych miejsc dla splicingu mRNA i poliadenylacji z regionu kodującego (dotyczy najczęściej genów bakteryjnych) miejsca te powodują zbyt szybkie zakończenie translacji i powstawanie skróconych białek • modyfikacja sekwencji w celu eliminacji rzadkich dla rośliny kodonów • wprowadzenie intronów do sekencji 5’UTR powoduje znaczące zwiekszenie ekspresji transgenu – mechanizm słabo poznany

8. Zwiększanie ekspresji transgenu c.d.n. • umieszczenie wzmacniacza GAL4 z drożdży przed promotorem powoduje powstanie nowego miejsca oddziaływania ze sztucznymi czynnikami transkrypcji (domena wiążąca DNA z GAL 4, a domena aktywatorowa z roślinnych czynników transkrypcyjnych) np. podobną metodę zastosowano do uzyskania transgenicznego ryżu • tworzenie mieszanych promotorów • w przypadku promotora 35S duplikacja całej sekwencji promotora lub wielokrotne powtórzenie sekwencji dystalnej w promotorze zwiększa poziom ekspresji

9. Charakterystyczne cechy regulacji transkrypcji u roślin • Transkrypcja regulowana u roślin jest bardzo specyficzna w stosunku do danego gatunku i danego typu komórek np.u Arabidopsis odkryto 2 – 3 razy więcej genów kodujących czynniki transkrypcyjne niż u Drosophila czy Caenorhabditis elegans • W roślinach nie opisano dotychczas wzmacniaczy o tak dalekim zasięgu jakie spotykamy u ssaków • Nie występują również wzmacniacze oddziaływujące z pozycji trans

10. Geny kryptyczne • elementy regulatorowe, które w swoim oryginalnym położeniu są nieaktywne, po zmianie położenia wykazują aktywność • istnieją we wszystkich organizmach jako promotory, wzmacniacze transkrypcji i translacji oraz sygnały poliadenylacji i miejsca splicingu • regulują ekspresję konstytutywną i komórkowo specyficzną • są bardzo liczne w genomie i tworzą zbiornik elementów regulatorowych, które mogą być nabyte przez geny

11. Geny kryptyczne c.d.n. • zmiana ich miejsca połżenia może zachodzić na skutek niesymetrycznego crossing over, a także poprzez transpozony

12. Remodelowanie chromatyny • w procesie tym biorą udział kompleksy remodelujące chromatynę CRM oddziałujące z ogonkami histonów powodując niewielkie zmiany w strukturze nukleosomów, co umożliwia ich przemieszczanie • w efekcie pozwala to na wiązanie się do DNA białek biorących udział w ekspresji genów

13. Remodelowanie chromatyny c.d.n. • promotor genu fazeoliny (białko zapasowe występujące w liścieniach fasoli) jest indukowalny ABA w nasionach, natomiast wprowadzony do liści transgenicznego tytoniu nie wykazuje aktywności. Powodem tego był brak w liściach czynnika PvALF (powoduje zmiany w konformacji chromatyny umożliwiające przyłączenie się czynnika transkrypcyjnego TFIID do promotora) • przy stałej ekspresji PvALF w liściach transgenicznego tytoniu promotor fazeoliny staje się aktywny i indukowalny ABA

14. Acetylacja histonów • acetylacja ogonków histonów (zasadowe fragmenty N-końcowe) katalizowana przez acetylotransferazy histonów osłabia oddziaływanie DNA z histonami • deacetylacja przeprowadzana przez deacetylazy (HDACs) wzmacnia te oddziaływania • badania na mutancie Arabidopsis PICKLE z mutacją w HDAC wykazały brak zahamowania ekspresji genów embrionalanych, co uniemożliwiło dalszy rozwój zarodka

15. Metylacja histonów • związana ze zmniejszaniem stopnia acetylacji histonów i dlatego indukuje powstawanie bardziej upakowanych struktur chromatyny w metylowanych rejonach chromosomowego DNA • mechanizm wyciszania genów poprzez metylacje DNA nie jest u roślin dokładnie poznany

16. poznanie molekularnych mechanizmów ekspresji genów pozwala na wydajniejsze konstruowanie roślin transgenicznych • ułatwia zrozumienie procesów metabolicznych zachodzących w roślinie